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1、Folin-酚试剂法(Lowry法):灵敏度高(~5mg),原理是双缩脲反应,磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原,干扰物质有硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、各种硫醇.需时50分钟左右。具体方法见《药典》第三部。检测重现性好。主要蛋白质产品的定量检测。现在有商品的Folin试剂(Bio-Rad等公司),不用实验室自己配制,克服了此方法的一大缺点。生化生物药品的质量标准中的蛋白定量大都用此法。
2、考马斯亮蓝法(Bradford法):1976年由Bradford建立。灵敏度最高(1mg),比Lowry法灵敏约4倍。原理是考马斯亮蓝G-250与蛋白质(主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基)结合时,其最大吸收由465nm变为595nm。干扰物质有强碱性缓冲液、TritonX-100、SDS。需时20分钟左右。目前科研单位、高校普遍用此法,我感觉稳定性比Lowry法差一些。
3、凯氏定氮法(Kjedahl法):最精典的蛋白含量测定方法,操作步骤多,复杂,要求的技术也较高一些。将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定,计算氮量,蛋白氮乘以6.25即推算出蛋白质含量。不少生化药用此法定氮或测蛋白含量。
4、紫外吸收法:原理是蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。测定时,将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白质溶液的溶剂(水或缓冲液)作空白对照,在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值OD280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿,盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时,OD280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
5、双缩脲法(Biuret法):灵敏度低(1~10mg),原理是多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物,用于快速测定,但不太灵敏;准确度低一些。
6、总蛋白定量分析-BCA(Bicinchoninic acid,二辛可宁酸、二羧基二喹啉):BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000μg/ml,45分钟内完成测定。原理是碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。