【求助】提质粒的时候加了３ｍｌ菌液，

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标题:【求助】提质粒的时候加了３ｍｌ菌液，

hcy517[使用道具]
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发表于 2016-3-26 09:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

把ＰＥＴ２８ａ转到ＤＨ５α里平板培养后挑单克隆过夜培养，菌液ｐｃｒ检测全是阳性。然后我把培养液每管加至５～６ＭＬ（是不是有点多了？）再过夜培养提质粒。提质粒的时候加了３ｍｌ菌液，用天根试剂盒提的，回收后竟然浓度超低。还有不到１０ｎｇ／ｕｌ的，最高的也才不到７０ｎｇ／ｕｌ，是不是哪里出了问题？

886爱[使用道具]
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发表于 2016-3-26 09:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

ET28拷贝数不高
还有，干嘛要摇两次？为什么不拿菌液PCR剩下的菌提质粒？还有，没必要菌液PCR，容易出假阳性

huali[使用道具]
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发表于 2016-3-26 09:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

因为只有3ml菌液，那天提了一下质粒，发现浓度很低，于是重新摇菌加大菌液量提，浓度还是很低。刚刚用这一批浓度很低的质粒（最大的一管浓度70ng/ul,峰也很正常）做双酶切跑完电泳竟然什么也没有，那我提的到底是啥呀，pcr阳性又是咋出来的？

wawa11[使用道具]
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发表于 2016-3-26 09:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

提质粒的菌液增加到5~6ml，按照质粒提取kit说明提高得率
质粒PCR
酶切反应体系不要用水，全部用质粒。或者你把酶切体系发一下
至于菌液PCR为什么容易出假阳性，自己找找

美人鱼[使用道具]
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发表于 2016-3-26 09:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

我查过了。想起当时做菌液pcr的时候扩增出的条带并没有当初连T载体的时候菌液pcr的那么亮，也许真的可能是假阳性。
酶切体系我全部用的提的质粒，没有水。可是跑空质粒也是什么条带也没有。所以我怀疑质粒根本没有转进去。
可是为啥质粒没转进去菌还能在有抗生素的板子和菌液里长呢？？好奇怪

daomei[使用道具]
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发表于 2016-3-26 09:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

啊说错了不是空质粒，是酶切前的质粒

妮子@[使用道具]
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发表于 2016-3-26 09:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

看来楼主和我一样(⊙o⊙)我送出去测序都没信号，这个低拷贝太坑爹了！

rrra6[使用道具]
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发表于 2016-3-26 10:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

用过psc101*/ts么那个拷贝数才低
pet系列这种pbr322的随便做也很容易看到。

蓝色雨梦[使用道具]
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发表于 2016-3-26 10:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

那童鞋你提出来的质粒浓度多少，双酶切验证有条带么？

小熊妮妮[使用道具]
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发表于 2016-3-26 10:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

【回复】

没测浓度，跑电泳时与maker对比，估计有50ng/ul吧。双酶切有很虚弱的条带

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