[求助]我的PCR跑不出带,但点样孔是亮的,这是怎么回事啊? - 经验共享

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标题:[求助]我的PCR跑不出带,但点样孔是亮的,这是怎么回事啊?

JK.jon[使用道具]
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发表于 2011-10-22 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我以前也遇到过这种情况，模板多做几个梯度
或者换块新胶在跑以下电泳试一试吧

阳光树[使用道具]
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发表于 2011-10-22 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这一周我也正为此发愁，我用的模板量是200ng（基因组DNA），所有的条件都试过了，就是没有条带连以前跑出的现在也不行了！

菜鸟丙[使用道具]
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发表于 2011-10-22 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是这样,粘两张图,一张是我还是个新手是做的,另一张是今天做的,以前好好的,现在就是没条带了,什么都没变,就是模版变了,是浓度太高了么?

附件

2011-10-22 16:41

51602359.jpg (23.06 KB)

冰岛老叟[使用道具]
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发表于 2011-10-22 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我把浓度降低了但还是没有带出来,只是点样孔不亮了,最后我换了一家公司的Taq酶之后就又有带了,所以我觉得不一定是模板浓度高了引起的,还有可能是Taq酶的问题。

queen[使用道具]
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发表于 2011-10-22 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不好意思，我降低PCR模板浓度后就做出来一次条带，之后再重复仍然出现点样孔内高荧光，却跑不出点样孔了。而且经测模板OD值，浓度并不高。所以我目前也不知道该怎么办了。可能是模板的问题吧。因为我换用对照DNA，用同样的酶、反应体系及PCR条件，可以出现特异性条带。不过邪门的是，我酶切之后的双链cDNA却又在点样孔内出现大量滞留。酶切前的却能跑出来。怪事了。

standbyme[使用道具]
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发表于 2011-10-22 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有的时候退火温度过高，延伸时间过长，也会产生东西堆在胶孔中的情况

windy+++[使用道具]
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发表于 2011-10-22 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可能是引物特异性不强，没能与模板结合，稍微降低退火温度试试，比如0.5度

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