【转帖】【分享帖】PCR技术概论

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【转帖】【分享帖】PCR技术概论

23 1/3 1 2 3 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【转帖】【分享帖】PCR技术概论

987789[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2016-4-4 10:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR技术简史
PCR技术的基本原理
PCR反应体系与反应条件
PCR反应特点
PCR扩增产物的分析

　　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项**性创举和里程碑。
PCR技术简史
　　PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
　　PCR的改进与完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
　　1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

987789[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2016-4-4 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR技术的基本原理

　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
　　(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝
　　PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
　　PCR扩增产物　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

987789[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2016-4-4 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：
　　　10×扩增缓冲液　 10ul
　　　4种dNTP混合物　各200umol/L
　　　引物　　　　　各10～100pmol　
　　　模板DNA 　　　　0.1～2ug　
　　　Taq DNA聚合酶　 2.5u　
　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
　　　加双或三蒸水至　100ul
　　PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
　　引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
　　②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
　　引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

987789[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2016-4-4 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR反应条件的选择

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
　　温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

987789[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2016-4-4 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR反应特点

特异性强：
　　　PCR反应的特异性决定因素为：
　　　①引物与模板DNA特异正确的结合；
　　　②碱基配对原则；
　　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
　　　④靶基因的特异性与保守性。
　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高：
　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速：
　　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低：
　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

987789[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2016-4-4 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR扩增产物的分析

　　PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
　　凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
　　琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
　　聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
　　酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
　　分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
　　Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
　　斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
　　核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法

woshituzhu[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75774
精华 1
积分 384
帖子 443
信誉分 102
可用分 3001
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态离线

发表于 2016-4-4 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我还想了解一下有关PCR分类及应用范围还有新的技术进展，帮帮忙吧！
关于in-cell PCR 有了解吗？我很需要这方面的文献呀！
救急吧！！！

vtongli[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107987
精华 1
积分 283
帖子 221
信誉分 102
可用分 1926
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2016-4-4 10:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

该技术先将抗体产生细胞进行固定和通透处理(permeated)，细胞保持完整状态，而PCR反应体系可以进入到细胞内，在细胞内进行逆转录反应，然后用一组寡核苷酸引物在细胞内扩增抗体轻重链可变区基因并组装成单链抗体结构，将扩增得到的多样性抗体基因构建成为抗体库，就可以用不同的抗原筛选到相应的抗体。这项技术能够确保扩增出的抗体基因轻重链配对与细胞内的原始配对相同，因此特别适用于天然自身抗体编码基因的研究。

idea2011[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77656
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2016-4-4 10:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

12楼
2、常用PCR分类、简介
（1）逆转录PCR
（2）定量PCR
（3）硷基替代PCR
（4）彩色PCR
（5）重组PCR
（6）不对称PCR
（7）膜结合PCR
（8）固着PCR
（9）原位PCR
（10）反向PCR
3.PCR在分子生物学中的应用
（1） cDNA文库的制备与筛选
（2）直接测序
（3）染色体区带中特异片段的克隆
（4）检测突变基因
（5）用简并引物法扩增未知序列
（6）应用PCR法标记DNA探针
（7） PCR与新基因的寻找
4.PCR在临床医学中的应用
（1）病原体检测
（2）遗传病的基因诊断
（3）肿瘤的早期诊断与转移确定
（4）用于器官移植的配型选择

987789[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2016-4-4 10:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR文献检索方法简介
检索途径
　　在进行文献检索时，我们可根据文献的内部特征或外部特征进行检索。
　　文献的内部特征是指文献所论及事物，所提出的问题，涉及的基本概仿即主题以及文献内容所属的学科范围都是文献的内部特征；
　　文献的外部特征包括题名，作者，作者单经以及某种特殊文献自身的特征标识。如专种文献的专利另科技报告的报告号，标准文献的标准号等等。
　　分类途经：从学科角度将文献内容划分到某一学科内，根据文献内容所属的类检索文献的途经即为分类途经，检索工具设置的分类途经主要遵循其选用的某种分类法，在分布在《中图法》的医药卫生类。用分类途经检索文献关键在于正确性解检索工具中的分类表，将要查课题划分到相应的类系中去。
　　主题途经：主题途径是指通过代表文献内容的名词术语进行检索的途径。通过主题途径检索文献的工具常见的有主题索引，关键词索引。主题索引。主题索引是用表达文献内容特征的经过规范化的名词术语按字排列而成的检索系统，而关键词索引是用来经过规范化的自然语言(关键词)，按字顺排列而成的检索系统。用主题途经检索文献关键在于分析课题，提炼主题概念，用语词表达出来。如果用主题索引还必须把自拟的语词用相应的词表核对，选用标准语词作为检索入口
　　题名途经：它是指根据文献的题名检索文献。由名检索语言献主要通过检索工具的出名索引，会议名称索引，书目索引等
　　作者途经：作者途经是通过已知作者(包括个人团体、机构、公司等)的中外文名称字顺来查找文献资料的途经。国外检索工具书大部分都有作者索引，便于按作者姓名进行检索。利用作者途经时，要注意国外作者姓名的写法，应按姓在前名在后的规定，依字顺查找。姓有单姓、复姓、父母姓边写、夫妻性边写。名有单名、双名、多名、敖名、父名等。还有的在姓名前题以荣誉称号及位，这都要注意按国外风谷习惯加以识辨才能进行准确检索。此外多作者的取舍、俄、日文姓名转成英文的部题，一般都有通用的规定，应注意工具刊的说明和有关译名的参考次料。
　　其他途经：它包括文献主序号途经(如报告号、专利号、标准号及合同号等)和分子式途经(为化学化工专业检索工具所特有)。以及动植和药物名称索引等各种途经。

23 1/3 1 2 3 ››