小中大五、PCR的基本反应体系
1、PCR
50 mmol/L KCl
10 mmol/L Tris·HCl (pH8.3 at room temperature，)
1.5 mmol/L MgCl2
100 μg/ml bovine serum albumin (BSA)
2 primers，0.25 μmol/L of each (50 ~ 100 pmol per reaction )
4 dNTPs (dATP＋dCTP＋dGTP＋dTTP)，200μmol/L of each
template DNA 0.1 μg
Taq DNA polymerase 2.5 units
temperature parameters:
94℃, 30s，55℃, 30s，70～72℃, 30～60s，25 ~ 30 cycles.
2. reverse-transcription PCR (RT-PCR)
reverse transcription:
mRNA (1μg/μl) 10.0μl
Oligo(dT)12-18 (1μg/ml) 10.0μl
1 mol/L Tris-HCl (pH7.6) 2.5μl
1 mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl2 2.0μl
4 dNTPs mixture, 5 mmol/L of each 10.0μl
0.1 mol/L DTT 2.0μl
inhibitor of RNase 25.0 units
add ddH2O to a final volume of 48 μl
2μl MMLV-reverse transcriptase
incubate the mixture at 37℃ for 1 hour. Then, incubate at 95℃ for 5 min to inactivate reverse transcriptase.
Take 5μl of reaction product as template in a standard PCR reaction system.
六、PCR技术的扩展
（一）多重PCR
多重PCR（multiple PCR）是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。由于每对引物扩增区位于模板DNA的不同部位，因而扩增片段长短不同，由此检测是否存在某些基因片段的缺失或突变。
杜氏肌营养不良症，抗肌萎缩蛋白基因
（二）筑巢PCR
筑巢PCR（nested-primer PCR）法先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特异性。
采用第一期PCR产物作为第二期反应的模板时，如果第二期PCR引物采用第一期反应的一条引物和互补于第一期扩增产物内的另一条引物（内侧引物），则成为半巢式PCR。半巢式PCR亦具有很强的特异性。
（三）二次PCR
二次PCR又称Boster PCR，是分二期进行的PCR，以第一次扩增的产物作为第二次扩增的模板。需要大量PCR产物时可采用此方法，不必每次都以原始模板进行PCR，这样可以节省模板。
（四）中断性PCR
中断性PCR（interrupted PCR），即半巢式PCR。
（五）共享引物PCR
共享引物PCR（shared primer PCR）是利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物。
这种PCR方法常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。也可用于确定基因重排。
（六）不对称PCR
不对称PCR（asymmetric PCR）是将两条引物以不同的浓度（一般为50׃1～100׃1的比例）加入反应液中，其中低浓度引物通常为0.5～1.0 pmol/L。在PCR前10个循环中，主要生成双链DNA产物。在低浓度引物逐渐耗尽时，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA，分离此扩增产物中单链DNA，利用原引物或扩增单链DNA序列内的引物直接测定序列。
（七）彩色PCR
彩色PCR（color complementation assay）又可直译为“着色互补性检测”。
不同的荧光物质可以发出不同的荧光色彩：
JOE（4',5'-dichloro-2',7'-dimethyoxy-6-carboxyfluorescein），绿色荧光
FAM（5'-carboxyfluorescein），绿色荧光
TAMRA（6-carboxylelra-methyl rhodamine）红色荧光
ROX（6-carboxy-x-rhodamine），红色荧光
COUM（7-amino-4-methylcoumarain-3-aceticacid），蓝色荧光
用不同的荧光物质标记PCR引物5'端，进行PCR扩增后的产物就含有不同色彩的染料，可发出不同颜色的荧光。用荧光激发灯观察电泳结果，可见到彩色产物, 并可彩色照相。
（八）反向PCR
反向PCR（inverted PCR）可以扩增已知序列两侧的未知序列。反向PCR亦可用于未知DNA片段的序列测定。用合适的限制酶将基因组DNA完全消化，然后用连接酶将未知序列两端连接成环状。利用单一限制酶原点切开已知序列，根据已知序列的碱基顺序设计3'端和5'端引物扩增未知序列。
（九）重组PCR
重组PCR是利用PCR技术进行DNA重组，可对DNA进行定位点突变、定位缺失，或进行两个DNA片段的重组连接。
1、用PCR方法进行DNA的定位点突变。
2、用PCR方法进行特定序列的缺失。
