PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因?

fei1226com[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79957
精华 0
积分 599
帖子 898
信誉分 100
可用分 5286
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
1
 

【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因?


从高GC%的细菌基因组中PCR扩增一个2500bp左右片段,电泳检测有目的条带、无杂带,但目的条带亮度弱,我增加了模板的用量但没有改善。
反应条件:
95度 5min
(95度 1min
60度 45sec
72度 3min)33个循环
72度 5min
请大家帮我出出主意。
顶部
jujuba[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79697
精华 0
积分 612
帖子 903
信誉分 100
可用分 5331
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态 离线
2
 
加大产量的方法一般有几种
1,加大镁用量
2,加大引物或者摸板用量,非必要不要用这种方法
3,采用降落PCR
对于楼主的问题,建议采用降落PCR,你的后23个循环,可以每循环降低退火温度0.2-0.3度,或者加大Mg的浓度
此外不要为了加大产量,就轻易的增加摸板用量,有的时候加大摸板用量也有可能抑制PCR,反而降低摸板用量或许可以得到更多的产量。
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
3
 
偶的拙见:
1. 模板的用量在你这种情况下应该和目的条带浓度关系不大——记得realtimePCR的原理图么,循环数够多时,目的片段的终浓度在不同模板量条件下相差不大;
2.首先考虑扩增效率问题,可用touch down PCR,除开头几个循环外,后面的退火温度降低一些,可提高扩增效率;
3.如果无效,建议使用两步法,95度 1min,(60-65)度 3min,可加入touch down 步骤;
4.不知道反应体系如何配置,应该是使用了GCbuffer吧?TaKaRa的GCbuffer(尤其是II)的确会降低一些扩增效率;
5.视你最终需要,如果是诊断目的,可多加一些Taq酶,也能增加扩增效率,但错配率和非特异扩增可能会增加。如果是克隆目的,其实目的条带暗一些很多时候并不影响最终实验结果。
有不当之处,请多批评。
顶部
fei1226com[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79957
精华 0
积分 599
帖子 898
信誉分 100
可用分 5286
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
4
 
谢谢楼上两位的建议。我做的目的是为了克隆(不是诊断)。我用的是天根公司的PCR Supermix,就是只需加入模板和引物就可以的,那上面说可以有效扩增高GC%模板。我是在50微升体系中加入3微升模板(模板浓度75ng/微升)。因为我还扩增另一个1000bp左右的基因亮度就很大,所以我想是不是2500bp的长片段比较难扩?
另外,请问楼上,什么是两步法?
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
5
 
如果增加Mg离子浓度的话,需要增加多少的量?我用的是Takara RNA pcr kit(AMV)Ver.3.0试剂盒,50ul体系,MgCl2(25mM) 2ul.
顶部
youreyes[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107975
精华 1
积分 461
帖子 578
信誉分 102
可用分 3691
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
6
 
正常的mg是1.5,可以提升到2.0,2.5,3.0,不过不建议太多,因为太多会发生非特异扩增
顶部
穿越时空[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79830
精华 0
积分 219
帖子 158
信誉分 100
可用分 1556
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
7
 
谢谢楼上!
我的RT条件是:
30 度 60min
42度 30min
99 度 5min
5度 5min 一个循环
Total RNA 500ng/ul
PCR条件是:
94 度 2min 一个循环
94 度 30sec
56度 30sec
72 度 1min 30循环
72 度 5min
跑电泳条带不亮,如果用降落PCR的话,可以增加扩增效率吗?怎样使用降落PCR?
顶部
XYZQ[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74654
精华 0
积分 533
帖子 725
信誉分 100
可用分 4481
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-13
状态 离线
8
 
72 度 1min ?时间短了点。150sec试一试,你要P的2.5K长。
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
9
 
谢谢!
我要P的不是2.5k长,而是408bp.我P的另外一个目的基因是685bp,条件同上,跑出的电泳挺好的.
顶部
bgf5[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76186
精华 1
积分 430
帖子 435
信誉分 102
可用分 3111
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
10
 
408bp的确不长,如果685bp扩的很好的话,要考虑你的引物是否有问题。
另外,你的RNA质量如何?有没有DNA污染,两对引物都是在外显子区还是跨了内含子,这些都是RTPCR必须考虑的因素。
顶部