PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 18  2/2 ‹‹12
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因？

bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
11

发表于 2016-4-4 22:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢!
这两个是同一批RNA,如果是RNA质量问题的话,那么685bp也应该扩的不好.我想现在改变一下RT-PCR的条件,看扩的怎么样.如果改变不行的话,那么就考虑是引物设计的不好.可是我现在不知道怎么改变反应条件,他们有说的要增加Mg离子浓度,或使用降落PCR,不知道有没有用过的,效果怎么样?
顶部
yapuyapu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76072
精华 3
积分 574
帖子 695
信誉分 106
可用分 4338
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
12

发表于 2016-4-4 22:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两步法就是退火延伸使用同一温度。
touchdown就是头几个循环退火温度逐步降低，然后在较低退火温度条件下进行剩余循环。
我扩增的GC含量高的样品都用的是TaKaRa 的酶和GC buffer。天根的不大好用。
后来熟了，也为了省钱，就用DMSO代替GC buffer，效果不错，不过浓度要摸索一下，
TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶，记得就是专门扩增长片段用的，可以试一下。
顶部
fei1226com[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79957
精华 0
积分 599
帖子 898
信誉分 100
可用分 5286
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
13

发表于 2016-4-4 22:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问可不可以用PCR扩增出来的产物为模板再做PCR来增加产物量？
顶部
社会主义好[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79862
精华 0
积分 184
帖子 128
信誉分 100
可用分 1371
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
14

发表于 2016-4-4 22:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以这样做，但是一般都要做个梯度稀释的，10－1000倍不等，但是这样产生突变的几率就增加了许多！
顶部
fei1226com[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79957
精华 0
积分 599
帖子 898
信誉分 100
可用分 5286
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
15

发表于 2016-4-4 22:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两步法就是退火延伸使用同一温度。
touchdown就是头几个循环退火温度逐步降低，然后在较低退火温度条件下进行剩余循环。
我扩增的GC含量高的样品都用的是TaKaRa 的酶和GC buffer。天根的不大好用。
后来熟了，也为了省钱，就用DMSO代替GC buffer，效果不错，不过浓度要摸索一下，
TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶，记得就是专门扩增长片段用的，可以试一下。
......

================================================

LA酶扩增的产量如何？听说还有一种pfx酶，那是什么呢？
顶部
yonger[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74174
精华 0
积分 572
帖子 803
信誉分 100
可用分 4861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
16

发表于 2016-4-4 22:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么用pcr产物再p，要做梯度稀释，为何产生突变的几率增加许多？
顶部
hot_hot_hot[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76450
精华 0
积分 389
帖子 498
信誉分 100
可用分 3247
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
17

发表于 2016-4-4 22:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
“TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶，记得就是专门扩增长片段用的，可以试一下。“
能否具体解释一下做法。我就在作长片段的扩增。15kb。正为用什么酶发愁那。
我用的是TaKaRa PrimerSTAR HS DNA Polymerase.您说的TaKaRa是什么酶？
顶部
8964357[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76997
精华 0
积分 273
帖子 266
信誉分 100
可用分 2118
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
18

发表于 2016-4-4 22:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TaKaRa LA Taq with GC buffer
code No. : DRR02AG
在目录书上有，你打电话给公司，告诉他们编号就可以。
顶部
 18  2/2 ‹‹12