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标题:【求助】请问如何消除引物二聚体？测序需要！

tie8[使用道具]
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发表于 2016-4-4 22:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问如何消除引物二聚体？测序需要！


师兄师姐好，750bp长度的PCR产物，扩增出来目的条带还可以，但是100bp下面有模糊的引物二聚体，有时甚至和目的条带一样清晰，之前不以为然，测序后发现不理想，请问如何消除这些恼人的小玩意？一般的方法我都试过了，好像效果不佳。:(
总之谢谢各位了，还请不吝赐教。小弟在此谢过先（PS:不太喜欢重新设计引物的方法，因为这对引物已经是所能找到的最合适的了）
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发表于 2016-4-4 22:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们也有这种情况，我们就在跑琼脂糖电泳的时候多跑一会，让二聚体的条带尽量跑在下面。不知道能不能满足你的要求。
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cbou876[使用道具]
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发表于 2016-4-4 22:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

尝试减少引物量，做个梯度，选取即能保证回收条带亮度，二聚体又最少。
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发表于 2016-4-4 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

恩谢谢各位了，不过问题还是没有解决哦。
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发表于 2016-4-4 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果减少引物浓度还不行的话，估计只能重新换引物了吧。
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bring[使用道具]
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发表于 2016-4-4 22:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各加２％，４％，６％DMSO试试看，做三个梯度，通过增加特异性减少二聚体。
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daod[使用道具]
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发表于 2016-4-4 22:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先我提个问题，为什么测序需要把引物二聚体去掉？
我讲讲我们这边测序，一般两种情况：1.有非特异性条带，直接切胶回收目的条带，纯化后送去测序就可以了。2.只有单一的特异性条带，用cleanup试剂盒过柱纯化PCR产物就可以了，一般小于75bp的条带都能去掉。Takara的据说可以除去100bp以下的片段。这种情况不需要跑胶的，我觉得应该适合你。
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发表于 2016-4-4 22:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物二聚体不影响你的测序，你的测序问题应该是其它的原因导致的，应该在别的地方招招原因。把你的胶回收之前的图看看！回收过程是否有污染，还有就是你的测序结果不理想到底是怎么样的不理想，最好截个图上来看看！
费劲找取出二聚体的方法缘木求鱼，而且二聚体存在一般是不影响实验的！除非产物被引物二聚体所覆盖，其余情况与其无关！
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 小中大

750bp长度的PCR产物，扩增出来目的条带还可以，但是100bp下面有模糊的引物二聚体
1,目的片段750，引物二聚体100，切胶回收对你的测序没有任何影响~~
2.不知道拟所说的测序不理想是什么不理想，建议做个克隆之后再测序~~
3，如果希望引物二聚体少点的话，你可以优化反应条件，引物二聚体过多是因为大量引物没有参与扩展，PCR效率太低的原因。可以考虑从退火温度和引物浓度入手做梯度优化~~~
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发表于 2016-4-4 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做二次ＰＣＲ，对消除引物二聚体效果不错．我试过．
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