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标题:【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度?

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发表于 2016-4-6 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度?

各位高手,向你们请教:
我从文献上查到我想要的引物,但文献上并没写此引物所能扩出的目的片段的大小,如何用某种工具如BLAST去找到该引物所能扩出的目的片段长度呢?万分感谢你们的帮助!
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发表于 2016-4-6 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
找到pubmed中Nucleotide界面，点击左侧工具条内的BLAST，进入blast界面，选择Nucleotide板块中的Search for short, nearly exact matches ，在Search 提供的空白区键入 上游（5‘-3’）nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn（20个以上的n）下游引物（5‘-3’），在其他选框中进行必要的限定。点击blast按钮。待进入下一界面后点击format, 待出现下一界面后，察看其中上下游引物能100%互补序列，用目的序列的最大碱基位置-最小碱基位置+1即目的片段的长度。需要补充说明的是，统一引物可能会blast到多条pcr产物，但目的片段的大小一致，主要是同一基因，有些提供的序列不完整造成的。
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发表于 2016-4-6 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的热情帮助,但我还是不太会找,比如我要扩小鼠的IL-4,文献中的引物为上游: 5’-TCGGCATTTTGAACGAGGTC-3’;下游:5’-GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC-3’,从BLAST搜到如下结果,那哪个是呢?"上下游引物能100%互补"是指谁和谁互补,怎么个互补法呢? 这个问题已经困扰我很久,万分感谢你们的再次帮助.
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langlang[使用道具]
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发表于 2016-4-6 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我搜到的结果在"我的IL-4"里,望不吝赐教.谢谢
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发表于 2016-4-6 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
5楼
楼主所用的引物在DNA和RNA中均能扩出来，下面这个是以DNA为模板扩出的片段，长度=91574-86987+1(bp)=4588bp
gi|3687208|gb|AC005742.1| Mus musculus chromosome 11, BAC clone CT7-111I18 (LBNL M01),
complete sequence
Length=159500
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 86987 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 87008
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 91574 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 91555
下面这个是以RNA为模板扩出的片段，长度=379-162+1(bp)=218bp
>gi|51826|emb|X03532.1|MMIGG1R Mouse mRNA for IgG1 induction factor
Length=580
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 162 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 181
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any333[使用道具]
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发表于 2016-4-6 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
准确地说，楼主的小鼠IL-4引物所扩增片段的大小应该为：
1、以RNA反转录所得的cDNA为模板，扩增产物为216bp（403-188+1）。
>gi|10946583|ref|NM_021283.1| Mus musculus interleukin 4 (Il4), mRNA
Length=605
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 188 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 207
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 26 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 45
||||||||||||||||||||
Sbjct 403 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 384
2、以基因组DNA为模板，扩增产物为4586bp（91574-86989+1）
>gi|3687208|gb|AC005742.1| Mus musculus chromosome 11, BAC clone CT7-111I18 (LBNL M01),
complete sequence
Length=159500
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 26 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 45
||||||||||||||||||||
Sbjct 86989 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 87008
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 91574 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 91555
对于所设计的引物，上游引物应该与模板序列某段完全相同、下游引物应该与模板序列的某段完全互补。下面看看用你的引物序列BLAST的结果，Identities后面的是引物序列与基因序列某段的匹配程度（如，100%），Query后面的是用于BLAST的引物序列，Sbjct后面的是与引物序列匹配的基因的某段序列。从BLAST结果可以看出，你的上游引物与小鼠IL-4基因序列的某段完全相同（注意上面的红色部分）；你的下游引物与小鼠IL-4基因序列的某段互补且完全匹配（注意上面的蓝色部分）。
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 小中大
今天向你学到了很多东西,还想向你问一个比较初级的问题,我是打算做RT-PCR,如果RT后变成以cDNA为模板做PCR所得结果不能把你所提的以DNA也能扩出的目的片段也扩出来吧?也就是说不会出现两条带吧 ,一个是4588bp,一个是218bp?cDNA是去除内含子的,所以与DNA是不一样的,做RT-PCR的化,应该只能出来218bp的目的片段,对吧?
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 小中大
楼上所选的扩增产物说明的是什么意思呢?与你所选的区别在哪里呢?他是选择了1-20 19-14,你选的是1-20 26-45,为什么会有不同选择呢?谢谢
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 小中大
楼上所选的扩增产物说明的是什么意思呢?与你所选的区别在哪里呢?
我和zzy1895所选的基因实际上都是同一个基因，即小鼠的IL-4（见下面的Other Aliases）。所不同的是，我选的是经NCBI整理过的、公认的小鼠的IL-4基因序列。
Il4
Official Symbol: Il4 and Name: interleukin 4 [Mus musculus]
Other Aliases: RP23-188H3.4, IgG1, Il-4
Chromosome: 11; Location: 11 29.0 cM
GeneID: 16189
他是选择了1-20 19-40,你选的是1-20 26-45,为什么会有不同选择呢?
这不是有不同的选择的问题，而是我和zzy1895进行BLAST时所用的序列有所不同。我用的序列是“上游引物”+nnnnn+“下游引物”，即TCGGCATTTTGAACGAGGTC nnnnnGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC ；而zzy1895进行BLAST时用的序列应该是“上游引物”+“下游引物”，即TCGGCATTTTGAACGAGGTC GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 。结果虽然看起来不一样，但实际上是一样的。对于zzy1895的BLAST结果，必须用你的引物序列和BLAST结果进行比较，找出引物在基因序列上的确切位置，这样才能准确算出扩增产物的长度。以zzy1895 BLAST结果中的、以mRNA为模板计算扩增产物长度为例（见下面），你的上游引物在该基因序列上的位置是162-181（见红色部分），下游引物在该基因序列上所对应的位置应该是377-358而不是379-358（见蓝色部分），所以扩增产物长度应该是216bp（377-162+1）而不是218bp（379-162+1）。
>gi|51826|emb|X03532.1|MMIGG1R Mouse mRNA for IgG1 induction factor
Length=580
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 162 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 181
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ero11[使用道具]
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 小中大

不好意思,还想向楼上请教,很难得遇见象你和zzy1895这么细心,耐心,水平高又热心的老师,为什么在我的下游引物前会多出来TC呢?
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
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