小中大看起来是样本提纯的问题,之所以浓度高的样本扩增曲线没有分得太开,可能的原因是样本不纯,存在很多其他的双链,导致荧光染料内插进双链发光,所以背景很高,虽然扩增结束后融解曲线有明显的峰,但背景高导致扩增产物经过很多循环其表征的荧光信号才能超越背景。
稀释后杂质也相应减少了,所以背景有降低,曲线背景和平台期区分得更明显些。其实Ct值在13~30之间都可以采用,只是模板浓度越低,样本稀释等问题越容易导致结果不准确。事实上,一般检测1000拷贝一下的样本,使用realtimePCR的染料法要慎用了。
在园子里检索一下,类似的问题有好多。