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标题:【求助】QPCR扩增效率太低

wiwi[使用道具]
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好像理论上95%-105%是算比较有效的扩增。
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我用的Evagreen,在ABI7500里扩增,用自带软件分析每次扩增效率都大于100%,一般都超过105%了。
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nut6694[使用道具]
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2倍的稀释度很容易产生误差(枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例)。
再加上你本身样品CT值就很大,通常来说CT值大于32可信度就已经降低了(因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。
所以你的标准曲线数据重现性会很差,计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因,然后再用PCR后产物(最好是10倍等比稀释7个梯度,每个梯度做三个重复)来做标准曲线。
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ending[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 nut6694 于 2016-4-6 14:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

2倍的稀释度很容易产生误差(枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例)。
再加上你本身样品CT值就很大,通常来说CT值大于32可信度就已经降低了(因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。
所以你的标 ...

谢谢,很好的建议!以后尝试下。就是有个问题,以前我相同方法,试剂什么也一样的情况下,这个基因CT值有30的,现在补做扩增效率,怎么也达不到30了,只有33左右。这是什么原因,模板降解了吗?我都是放在-20度的,就这次用的时候解冻了下。
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nut6694[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 ending 于 2016-4-6 14:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢,很好的建议!以后尝试下。就是有个问题,以前我相同方法,试剂什么也一样的情况下,这个基因CT值有30的,现在补做扩增效率,怎么也达不到30了,只有33左右。这是什么原因,模板降解了吗?我都是放在-20度的,就这次用的时候解冻了下 ...

有几个潜在原因:
1)首先就是你所说的模板降解。
2)荧光染料随时间增加而敏感性降低。
3)qPCR软件在处理数据过程中设置的baseline和threshold前后有所差别也会导致单一CT value的变化。
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ending[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 nut6694 于 2016-4-6 14:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有几个潜在原因:
1)首先就是你所说的模板降解。
2)荧光染料随时间增加而敏感性降低。
3)qPCR软件在处理数据过程中设置的baseline和threshold前后有所差别也会导致单一CT value的变化。 ...

是啊,我的染料4月份就过期了。可能是这个的原因。
另外我最近一直有个关于兼并引物的困惑,一直没有被解答,很着急,能麻烦您有空的时候帮我解答下吗?不甚感激
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xyw5[使用道具]
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因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。

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能否详细解释下这句话什么意思?本人数学不是很好。。。谢谢
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33号[使用道具]
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能否详细解释下这句话什么意思?本人数学不是很好。。。谢谢

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举个简单例子说明这个问题:
1) 假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去,那么大致能对半分,也就是500:500(1:1)的关系。
2) 然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去,那么还是能大致对半分。
3) 如此反复进行。。。。
4) 当最后剩3个绿豆,现在再闭上眼睛从中间切下去,就有很大概率是一边3个,另一边0个(即 全 或 无的关系)。
因此,如果绿豆数量多的时候,闭上眼睛从中间切下去,大致能对半分,这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候,闭上眼睛从中间切下去,绝大部分情况是全或无的关系, 这时就服从贝努里分布。
回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” (强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA,保证随机性)。
当DNA稀释服从线性分布时,这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时,这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢? 因为计算机存储是 0与1, 也就是 全 或 无。 以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理,是数字信号,区号于模拟信号。
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vvmmoy[使用道具]
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最近在做QPCR之前用罗氏的SYBR做得很好,扩增效率均在95%,引物溶解曲线是单峰,特异性好。但是老板换了TOYOBO的SYBR同样的体系扩增效率下降了60%,扩增效率很低,荧光染料也会影响扩增效率么?
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yhtfyl[使用道具]
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感谢楼主分享,受教了
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