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标题:【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题

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【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题

各位高手请不吝赐教。。感激不尽。。。
我做的RNA反转,现在提到的RNA浓度有1000ng/μl,然后用的TAKARA的反转试剂盒。
是要做荧光定量的,所以想先做个普通的PCR看看引物的效果。。。
请教大家用一个25μl的体系怎么样,怎么配比较好?。
我是新手。。。完全没有概念。。。
加cDNA模板的浓度要求是多少?
谢谢大家⊙﹏⊙b。
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ending[使用道具]
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不要超过PCR体系的10%。
逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。
另外,配制PCR体系,每种成分的加样量不要低于1ul,不然实验重复性会非常糟糕了;引物和PCR成分可以事先预混,cDNA可以稀释后再加。
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QUOTE:
原帖由 ending 于 2016-4-6 15:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不要超过PCR体系的10%。
逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。
另外,配制PCR体系,每种成分的加样量不要低于1ul,不然实验重复性会非常糟糕了;引物和PCR成分可以事先预混,cDNA可以稀释 ...

谢谢您的指点。。我是不是可以把除了 模板和taq酶之外的其他组分先配成MIX,然后分到每个管中?。。。我师姐说必须要按顺序一个一个的加。。。但是我觉得先混合成MIX没有区别啊
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SO2[使用道具]
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如果用相同的引物,可以把模板之外的所有成分预混,最好所有PCR成分都预冷,预混后放冰上。
在冰上操作是为了减少非特异性扩增,因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理:各成分绕PCR管加在壁上或者盖子上,最后离心混合,也是为了减少非特异性扩增。但是那样做的话加样误差太大,实验重复性不高。
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QUOTE:
原帖由 SO2 于 2016-4-6 15:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果用相同的引物,可以把模板之外的所有成分预混,最好所有PCR成分都预冷,预混后放冰上。
在冰上操作是为了减少非特异性扩增,因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理:各成分绕PCR管加在壁上或者盖子 ...

谢谢你的指点。那混合后能不能涡旋一下?我听有人说有酶的都不能涡旋。。。但是我们一直都是涡旋一下再离心。。。
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Taq 和pfu之类的酶都很强悍的,涡旋一下不会有影响的
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shenkunjie[使用道具]
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建议不要把引物和buffer还有酶预混,酶在低温也是有活性的,容易形成引物二聚体,而且万一你的引物设计的有问题,那你混好的东西就全浪费了。
1000ng太高了,可以稀释成100ng/ul,然后加1ul就够了,甚至有人告诉我她用30ng也能扩出来,不过我一直用100ng
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QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2016-4-6 15:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
建议不要把引物和buffer还有酶预混,酶在低温也是有活性的,容易形成引物二聚体,而且万一你的引物设计的有问题,那你混好的东西就全浪费了。
1000ng太高了,可以稀释成100ng/ul,然后加1ul就够了,甚至有人告诉我她用30ng也能扩出 ...

那么除了酶、模板之外其他的成分(buffer,mg,dNTP,水)先混起来做个Mix应该没有问题。对吧?
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any333[使用道具]
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恩,不过一定要按比例混匀,每次拿出来P的时候也最好涡旋一下
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33号[使用道具]
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你好,你一直用的100ng/ul 是在做普通PCR时的cDNA的用量吗?
谢谢
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