PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
1

发表于 2016-4-6 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

想问一下，相隔十个bp的片断在聚丙烯酰胺凝胶电泳中好不好分离啊？有没有哪位做过这么小片段的分离。谢谢了。
顶部
33号[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74277
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4611
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
2

发表于 2016-4-6 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该可以分离的，因为聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来检测点突变和基因微卫星，都是对小片段异常的检测，分离10bp片段应该是可以的，但要注意选择合适的胶浓度和交联度，可以参考分子克隆书
顶部
45778[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117864
精华 0
积分 272
帖子 283
信誉分 100
可用分 2141
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
3

发表于 2016-4-6 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为，用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨不出的，
1.双链DNA分子存在构象上的差异，其直链，环与超螺旋的迁移率有一定差别，在带型判定上会引起混淆
2.普通聚丙烯酰胺凝胶电泳的有效分辨率只有在凝胶浓度达到20%时，分辨率才能达到10bp，但此时的分辨范围只有10bp-100bp，恐怕不能达到实验要求。
建议使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，即加入8M尿素的聚丙烯酰胺凝胶，尿素可使DNA双链打开全部呈单链状态，消除了构象带来的干扰，分辨率最高可达1bp。
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
4

发表于 2016-4-6 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼上的战友，用同样的样品（标准）做单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳＆双链聚丙烯酰胺凝胶电泳，其结果一样吗？有什么差异吗？急！
顶部
HPLC使者[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76541
精华 0
积分 250
帖子 260
信誉分 100
可用分 2011
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
5

发表于 2016-4-6 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回楼主：
我做过相差这么大的片段，用非变性聚丙烯酰胺凝胶肯定没问题，具体用多大浓度，就看你的片段长度了，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:
DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%)
1Kbp～700bp 3.5
700bp～500bp 5
500bp～200bp 8
200bp 12
顶部
viviwang1987[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77490
精华 0
积分 458
帖子 636
信誉分 100
可用分 3953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
6

发表于 2016-4-6 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了一个月了可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶分开10bp的DNA片断。用的是12%浓度胶。电泳仪和电泳槽是美国amersham公司。marker是大连宝生物公司20bp梯度marker，范围是20-200bp。你的电泳片断在200bp以下应该可以分出。
电压是50v，时间是3h。胶为9cm长，20bp，40bp，60bp间隔约1.5cm。
顶部
u76mp[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107971
精华 3
积分 336
帖子 259
信誉分 106
可用分 2121
专家分 30
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
7

发表于 2016-4-6 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近也要做PAGE,我的目的片段在50－150bp，我也觉得选择非变性PAGE，浓度大约在8%－12%比较合适，但是我还有一个疑问：在分子克隆书 书上提及的关于染料溴酚蓝的迁移率是什么意思啊，对电泳分析结果有什么影响吗？谢谢指教
顶部
8princess8[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75310
精华 1
积分 664
帖子 821
信誉分 103
可用分 5056
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态 离线
8

发表于 2016-4-6 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
6%-12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶可分开4bp的片段，若是变性聚丙烯酰胺凝胶甚至可分开2bp的片段。现在很多法医实验室就是用PAGE胶银染方法进行4bp重复的STR等位基因分型。
另外一点就是电泳时间最好久一点，2~3小时，根据玻璃板的长度和电压而定。所以玻璃板最好要长点，30~40cm为佳。但象你只分开10bp片段，无需这么长，20cm左右就可以了。
顶部
idea2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77656
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态 离线
9

发表于 2016-4-6 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们法医物证教研室就用的浓度为6%交联度为4%的PAG，电泳槽是自制的，通过银染的方法进行STR基因分型，重复单位是4bp，效果很好啊。
关键是实验室的设备条件的差异，需要选择最合适的电泳条件。我们用的是恒流，当然也可以恒压电泳。
顶部
idea2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77656
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态 离线
10

发表于 2016-4-6 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助: 我的两个片段是750BP左右,它们相差十几个BP,我想分开这两个片段,并且想回收.请问我该用多大浓度的胶? 怎么回收?用银染可以回收吗?和用EB回收方法一样吗?
顶部
 13  1/2 12››