【求助】pcr引物问题 - 经验共享

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标题:【求助】pcr引物问题

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发表于 2016-4-6 17:01 资料个人空间短消息加为好友

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Blocker Maker 的网址如下：
cuturl('http://blocks.fhcrc.org/blockmkr/make_blocks.html') 主要功能是计算多个同源氨基酸序列的共有保守框（我认为这与生物信息学参考书上模体（motif）的概念十分相似。计算好的保守框当然是选择基因特异性引物的最适区段。
直观的结果如下图所示（我研究的蛋白有两个Motifs)
另外在分析结果里不要忽视了Coden Hope （名字即得不很清了）功能，它可以帮你设计出一种很奇怪的引物，3｀端保守，5｀端间并，引物长度都长于30bp，甚至可到60bp,我曾经试过这种引物，扩增条带不象正长PCR那样“漂亮”，但至少从新物种中克隆出了想要的片段，这为后续的RACE打好了基础。
还有两点体会：
:8)设计好的基因针对性引物最好在NCBI－Blast中用search for short nearly match工具验证一下他的特异性，一般情况下一对引物只要有一条的特异性较高的话，就不妨开始P了。当然了，反向引物验证时别忘了要拿他的互补序列。
:8)coden hope 设计的引物较长,所以退火温度一般稍高,建议适当调低一点,具体低多少,要自己摸索,其实正规情况下PCR反应多个条件都需自己优化,Mg离子浓度,Primer浓度，模板量等等，总之要有perfect的结果，就要double check,double efforts.
Good Luck