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标题:【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题

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发表于 2016-4-7 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
帮小弟一把，我做了很长时间了，可就是不知道哪里出问题了。会不会是chemicon的试剂有问题啊，请教tjmedwnn 你的PCR体系是多少？修饰前后DNA量有多少？能否把你的protocol传一份给我
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2016-4-7 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得PCR体系倒不是重要的啊，操作就是照试剂盒的说明书一样啊，你先说说你的问题所在吧，是PCR扩后没带还是什么啊，你确定你的标本就一定是甲基化标本吗？
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发表于 2016-4-7 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在用的是细胞系做的Raji,Hela。文献上Raji是甲基化的，我做出来有很多非特异带，没有目的带（应该是100bp左右）。我的引物是文献上的，在做的过程中有什么需要特别注意的
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发表于 2016-4-7 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以试一下做一个梯度PCR，从文献的退火温度向上下各5度
还有就是你在加DNA模板的时候千万主意不要加进去沉淀（就是试剂III），另外不知道你在修饰的时候加试剂IV了没有啊，没有就最好加一下。
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2016-4-7 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过梯度，试剂IV不是要样本量不足时才加吗？我的DNA量够，所以就没有加，
是否应该在用ＴＥ溶解后，再离心使试剂III沉淀后吸取。
我试试，回头告诉你结果
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发表于 2016-4-7 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的结果怎么样了啊？
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发表于 2016-4-7 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

已经看到有目的条带大小的条带出来了，我想应该是吧，但是非特异的杂带也很多，今天重复设了模板和温度梯度可是目的带没有了，不知是怎么回事
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发表于 2016-4-7 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

给上面的朋友推荐一个好的实验方法论坛 protocol online论坛: 是美国华人所办，版主都是美国实验顶尖高手。有许多实验中的疑难问题的解决方法。尤其是甲基化实验。
cuturl('http://www.protocol-online.org/forums/index.php?showforum=6/')
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发表于 2016-4-7 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正在准备这个实验，国外师兄推荐的这个MSP的方案值得参考。他是一次就成功的。
cuturl('http://www.mdanderson.org/departments/methylation/dIndex.cfm?pn=A3F15D82-C9B4-41CD-BA4BE767E50A73D2')
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发表于 2016-4-7 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我知道这个网站，上面的protocol是手工修饰，我用的是试剂盒，昨天做出来的结果不错，带清晰背景干净，但是非甲基化也有大小相似的带出来（样本是甲基化的），怎么回事？
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