PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】何谓touch down PCR?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】何谓touch down PCR?

PCR[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74238
精华 0
积分 414
帖子 448
信誉分 100
可用分 3201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
1
 

【求助】何谓touch down PCR?


谁能解释“touch down PCR"的具体内容?
顶部
33号[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74277
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4611
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
2
 

Touchdown PCR involves decreasing the annealling temperature by 1 degree C every second cycle to a 'touchdown' annealing temp which is then used for 10 or so cycles. It was originally intended to bypass more complicated optimization processes for determining optimal annealing temperatures. The idea is that any differences in Tm between correct and incorrect annealing gives a 2-fold difference in product amount per cycle (4-fold per degree C). You therefore enrich for the correct product over any incorrect products.
Another use for this procedure is in determining DNA sequence for a known peptide sequence. The strategy here is to use two sets of degenerate primers that match potential coding sequences at the two ends of a peptide of known sequence. In practice, this requires that you know a stretch of peptide sequence of only 13 amino acids, with left and right primers of 18 nt (6 a.a.) and a space in between of one or more nt. Using these degenerate primers, you do a touchdown PCR. You will get a huge number of products, but you can select the desired product based on size since you know the exact interprimer distance from the peptide sequence. The advantage of this technique is that the touchdown PCR enriches for products containing correct matches between primers and template. If you clone and sequence a dozen PCR products, you can determine the correct coding sequence for the peptide, design an oligo for hybridization, etc. The technique is especially useful for peptide sequences full of ser, lys, and arg (six codons each).
顶部
33号[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74277
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4611
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
3
 
For more information see:
Don, R. H., P. T. Cox, B. J. Wainwright, K. Baker, J. S. Mattick. 1991. Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 19:4008-
转贴自cuturl('http://bip.weizmann.ac.il/mb/bioguide/pcr/PCRTouchdown.html')
顶部
555444[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118099
精华 1
积分 359
帖子 413
信誉分 102
可用分 2836
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
4
 
Touch down(TD)PCR是一种特殊技术。采用它我们可以不需做预实验来进行条件选择,只需要做一次正式实验,就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的,绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。
其基本操作是:根据对引物Tm值的计算,确定一个退火温度的大范围(不是一个点,而是一个可以跨越10~20度的范围),计算的Tm值应落在这个范围中间。在做扩增周期程序设定时,让退火温度从选定范围的最高温度开始逐步降低温度,每次降低一度,最后结束在选定范围的最低温度处。在每一个停留温度上循环两次。这样,引物在某一较高温度下与模板复性并引发延伸合成产物,通常是特异性扩增产物,因为它是在最早也即Tm值较高的条件下引发合成的,在随后退火温度继续下降的过程中,上述的延伸合成会继续进行。可以想象,在退火温度下降过程中,很有可能引物还会在模板上找到第二个复性并引发延伸的部位,但是由于该位点是在更低的Tm值下与引物复性的,故通常是“假阳性扩增”。这两个产物在含量上有极大区别。如果特异性扩增带与假阳性带之间的Tm值相差3度,由于在每个温度上进行两次循环,故特异性较高的合成产物经过了6次循环后假阳性产物才开始合成,故特异性产物的量大于假阳性产物的64倍(26),两者在量上是不难区别的。TD PCR的缺点就是它的程序设定比较复杂,由于要用到一系列的变化的退火温度,故要占用PCR仪中的大量程序容量。
顶部
555444[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 118099
精华 1
积分 359
帖子 413
信誉分 102
可用分 2836
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-12-9
状态 离线
5
 

说得土点,是慢慢降低退火温度,从高到低,使得扩增的片断保证在前面几个循环中是特异的,到后面特异的模板比非特异的高,在后面的循环中间,非特异带竞争不过特异带。
一般是从70-60度,如果你的引物TM在65度以上,设计度要求是从开始的Tm+5(10) 到Tm-5(10),剃度温度到降低取决于PCR仪,大部分都可以做的到。
顶部
queen[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72228
精华 1
积分 361
帖子 337
信誉分 102
可用分 2571
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
6
 
“TD PCR的缺点就是它的程序设定比较复杂,由于要用到一系列的变化的退火温度,故要占用PCR仪中的大量程序容量。 ”胡说八道!
有几个人用老式PCR仪做降落PCR的,你用MJ的试试,程序设置和普通的PCR没有大差别的。
顶部
33号[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74277
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4611
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
7
 
TDPCR的确在设置程序的时候需要输入多个循环,应该是比普通的PCR复杂的多,输入的字符多了自然会占用较多 的PCR的程序容量的。
顶部
大仙[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70436
精华 0
积分 178
帖子 116
信誉分 100
可用分 1291
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
8
 
TDPCR的确在设置程序的时候需要输入多个循环,应该是比普通的PCR复杂的多,输入的字符多了自然会占用较多 的PCR的程序容量的。
顶部
9900[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75149
精华 0
积分 399
帖子 478
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
9
 

不好意思,问个很菜的问题,touch down PCR在普通的PCR机子上能跑吗?
还有一个问题就是,touch down PCR的效果与慢慢摸条件后PCR的结果相比怎么样?
顶部
ilovegaga[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108892
精华 0
积分 301
帖子 262
信誉分 100
可用分 2075
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
10
 
我觉得touch down PCR在普通PCR仪上也是完全可以做的,只不过必须一个循环一个循环地设置反应参数,虽然步骤相对要烦琐一些但仍然可以达到相同的效果。
顶部