小中大我有个具体问题:我有一个400多BP的反转录模板,引物TM值60(61),一开始用56-54-52-58均拉不出来,后来分析序列中GC含量很高(70%),故提高TM至60,这次拉出来了,目的条带位置的模糊片断,分不太清,然后以此产物62度PCR,这次出来四条带,其中一条应为目的条带(和对照比位置一样)其它三条一条估计为引物二聚体,另两条只能是非特异了,然后我尝试将60度PCR的产物再作一次PCR,即应用touch down方法,提高特异性66-64-62,条带反而更弱了,还有四条,照理我提高退火温度,应该条带减少啊,,如何改进?清高人指点!万分感谢!!
