【转帖】RT-PCR经验浅谈二

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标题:【转帖】RT-PCR经验浅谈二

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发表于 2016-4-8 08:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很抱歉，这阵子忙了好久，没有时间来写后续的部分。因为第一次写的时候承诺过继续写下去的 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=323830&sty=3') 希望没有让等待的战友太失望。
言归正传：
这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题，在一般的逆转录反应中，较常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）两种，现在更有各家公司推出的耐热的（50-60度）、超长片段的逆转录酶，这方面具有专长的数gibco（现在并购于invitrogen）。
我们实验室使用的一般是MMLV，鼠源的酶，虽然活性比较低一点，但是对应的RNaseH活性也很低，在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。对于从细胞培养物中利用RT-PCR方法扩增mRNA丰度低的基因也很有效。但是AMV也有其自身的优点，酶的活性很高，扩增1kb以下的基因时比较常用，我知道临床上血液检测中有时使用AMV，省时，也省试剂。
另外，MMLV逆转录反应的条件比较好掌握，反应液的组分简单，AMV的反应液有的需要添加焦磷酸钠（这种试剂不好找到）。
反应温度最好每次都控制不变，MMLV我每次都使用37度，虽然mannual上说使用特异性引物可以升到42度进行逆转录反应，但是有一次42度没有扩增结果，改为37度却扩出了所需要的带（使用的20mer特异性引物），从此以后我一直使用37度，后来的结果也还可以。
长片段逆转录，比如某些RNA病毒的全基因组RT-PCR扩增，10kb左右，可以选用上面提到的耐热、RNaseH-的逆转录酶，可能比较贵一点，但是很多文献报到能够得到很好的扩增，本人尝试过，说实话，可能没有太认真去优化条件，很遗憾连设计的6kb都没有得到扩增产物。由此，我建议大家不要轻易尝试这个方法，一则扩增的难度确实存在，另外，扩增的忠实性不能得到很好的保证。不同的实验目的也不一样，一下子得到这样长的片段，后续的改造也很困难。
还有一个需要指出的问题是，有些同行喜欢一下子提很多RNA，加保护剂如RNase inhibiter等，冻存，以后长期使用，我不推荐这样做。RNA在低量存在时非常容易降解，任何保存方法都比不上不保存^_^，我的做法是马上做RT，不吃饭也要做上去，为了省去日后不尽的麻烦，切记切记！
各位，谈谈你的感受吧，抑或自己的亲身经历！（读后感踊跃撰写中.......）

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发表于 2016-4-8 08:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

由于做phd的时候，成功扩增过三株RNA病毒全基因组（一种病毒的三种强弱不同的毒株），所以手头积累了一些经验，并且真心希望与各位战友一起分享！我将根据大家跟贴情况和各位的需要，继续推出后面的部分。请各位多提意见，对于斑竹，希望能scored it

dog002[使用道具]
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发表于 2016-4-8 08:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你写得非常好,我现在正在做15KB的病毒基因,扩了好久了,一直没有扩出来,如果你有空的话,给我说说做病毒RT-PCR心得好吗?我是把这分成五段扩的,2--5KB.另外问一下,你做的病毒是不是细胞上培养的,如果是有没有经过纯化或浓缩,我以前没有经过这一步,现在想试试

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发表于 2016-4-8 08:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不要急，组织毒和细胞毒我都曾经做过，差别不是太大，总的感觉是病毒滴度越高，扩增成功率越高。你说的心得，不就在这里吗，另外还有一 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=323830&sty=3') 请参考，希望对你有帮助，多交流！

dog002[使用道具]
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发表于 2016-4-8 08:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我提得是细胞毒,马上做PCR,每次都是1---15KB的smear, 你能给我分析一下原因吗,另外我从质粒中扩同样的片段用同样的PCR条件能扩出来.谢谢!

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发表于 2016-4-8 08:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不太明白你的意思，希望你能够讲的详细一点，比如：目标片段长度，gc含量，引物分析报告（不能分析的话请给出序列，我给你看看），扩增条件，是否经过优化，怎样优化，结果有什么变化等。
从质粒pcr从来就没有出现过问题，除非使用质粒作为阴性对照，这个与RT-PCR太不一样了，不可同日而语！

coolcool[使用道具]
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发表于 2016-4-8 08:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我真是羡慕你这么顺利的RT-PCR，这个RT-PCR我已经做了半年了，才拿到7.5KB中的3KB，真是筋疲力尽了。有个问题想请教大侠，以您的经验M-MLV能反转录多大的片段

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发表于 2016-4-8 08:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我自己rt一个最长的片段是3.3kb，扩增特异性非常好，使用的是promega的mmlv，普通的那种，没有耐热、RnaseH-等特点。觉得如果再增长，应该也是可以的，不过后来做6kb的一个片段，就熄火了^_^。就我经验，普通条件下，4－5kb应该会是上限。

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发表于 2016-4-8 08:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 coolcool 于 2016-4-8 08:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我真是羡慕你这么顺利的RT-PCR，这个RT-PCR我已经做了半年了，才拿到7.5KB中的3KB，真是筋疲力尽了。有个问题想请教大侠，以您的经验M-MLV能反转录多大的片段 ...

你的实验现在进展如何？如果需要帮助，我可以尽力提供！
god bless you！

dog002[使用道具]
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发表于 2016-4-8 08:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好,在你和朋友的贴子的帮助下,加上我这半年的努力,在从昨天到今天,我已经成功的15KB中的12KB ,还有几个KB我打算明天扩出来,希望有空多交流,有时想想真是不爽,扩了四个月,成功只在昨天到今天二天,真是郁闷啊!!

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