【求助】RT-PCR一步法好还是两步法好? - 经验共享

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标题:【求助】RT-PCR一步法好还是两步法好?

eor[使用道具]
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发表于 2016-4-8 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 爱老虎游tt 于 2016-4-8 09:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问
1.RT-PCR一步法好还是两步法好?
2.有没有人用过Access RT-PCR系统,请介绍一点经验!
3.我看过DXY的一些帖子,现在头都大了,RT-PCR到底能不能定量?怎样做才可以达到半定量?
4.我不知道该买多大的试剂盒,有哪位高手 ...

一步法和二步法各有优缺点。
　二步法RT-PCR ：
（1）可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异性引物进行第一链合成。
（2) 高灵活性：可选用不同的酶系统。
（3）可优化困难的RT-PCR反应
（4）可实现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONG ASE Enzyme Mix) 。
（5）最适用于克隆产物(使用高确限度酶或混合酶) 。
一步法RT-PCR：
（1）第一链合成时只能使用基因特异性引物。
（2)高灵敏度：使用预混合的SUPETSCRIPT H和Taq聚合酶，可检测到低至0．1pg的mRNA。
（3）高便利性：所使用的酶已经预混合。移液步骤少，减少污染机会。
（4）产物长度，<3KB。
（5）最适于大量样品的分析
您可以根据你实验的要求来定。实验的经费我觉得买RT-PCR试剂盒可以先买一个25次的盒子试试，也就是1700—3000元左右，说不定你做熟了可以将反应体系减少一半，就相当于50次的了。

INK[使用道具]
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发表于 2016-4-8 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位同志大家好！有谁知道DDRT-PCR引物是如何设计的吗？可以给小弟推荐一些随机引物组合吗？谢谢！！！

uaubc[使用道具]
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发表于 2016-4-8 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

什么叫一步？
什么又叫两步？
谢谢，不吝赐教！

yhn[使用道具]
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发表于 2016-4-8 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一步法是提取的RNA，设定特异性引物直接进行特定GENE扩增。两步是将RNA逆转录为cDNA后再进行特定GENE扩增。

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