小中大2.7.2 凝胶的制备：
（1） 固定玻璃板
用0.4mm厚的边条置于长玻璃板左右两侧，将短玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）制备测序凝胶(6%)
先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后再加过硫酸铵和TEMED。
表2-1 聚丙烯酰胺凝胶浓度表
Table 2-1 table of the polyacrylamide gel strength
凝胶终浓度(%)
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
（3）灌制胶板
将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
（4）凝胶制备过程中的注意事项
a) 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
b) 溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。
c) 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
2.7.3 预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）先将水浴加热至55℃后进行预电泳。
（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟（恒功率80-90W,约30min）。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
（6）预电泳的注意事项
a) 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果；
b) 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪；
c) 厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。
2.7.4 上样及电泳
（1）关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素。
（2）PCR扩增产物:甲酰胺上样液（98%甲酰胺，10mmEDTA，0.25%溴酚兰）8:3混合，95℃变性8min，然后立即冰浴。如果样品长时间不用，则应重新处理。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。AFLP选择性扩增产物95℃变性8min，然后立即冰浴。
（3）立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长，0.4mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。
（4）上样及电泳的注意事项
a)上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳；
b)一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
2.7.5 测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
（1）电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在长玻璃板上。
（2）固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定溶液浸没,充分振荡20分钟或至样品中染料完全消失，胶可在固定溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定溶液，用于终止显影反应。
（3）洗胶：用超纯水振荡洗胶2次，每次8分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽，再进行下一次洗涤。
（4）凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
a) 显影液的配制：在已冷却至10℃的碳酸钠溶液中，加入37%甲醛(3ml)和10mg/ml的硫代硫酸钠溶液(400μl)。往染色盘中倒入预冷的反应液1升，放在一边，其余反应液仍放在冰浴中。
b) 胶从染色液中取出，放在一边，染色液回收到烧杯中，盘清洗后加入超纯水。
c) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复用染色液浸泡处理。
d) 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2-3分钟,或直至所有条带出现。
e) 终止显色反应：弃掉显色液，加入1升终止溶液，摇床反应2－3分钟，停止显影反应,固定凝胶。
f) 洗胶：在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
g) 干胶：将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
（5）测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响：
a) 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现；
b) 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，高纯度的碳酸钠，一般可获得较好的结果；
c) 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行；
d) 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒；
e) 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色；
f) 临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液；
g) 不要重复使用任何溶液。
祝各位战友实验顺利。
