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标题:【求助】关于荧光定量PCR的假阳性问题（探针法）

any333[使用道具]
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发表于 2016-4-8 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于荧光定量PCR的假阳性问题（探针法）

用荧光定量PCR检测一个基因，用的探针法。现在有两个问题：
1. 我的无模板对照总是出现曲线，在10-30循环，没有固定的位置。起初以为是污染，可更换了新的水、dNTP、探针等，基本都换了新的，还换了加样的地点，换了加样的枪，仍然出现，没有什么区别。不知道为什么？
2. 用或不用模板，总有些曲线是斜行抬高的，就是从一开始就斜着上去的。以为是探针降解，可探针也是刚买的，用TE缓冲液溶解后还是比较注意操作的。
求助各位，谢谢
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any333[使用道具]
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发表于 2016-4-8 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是刚买的探针，买回来之后单独对探针跑线，都能跑出线，但不是S型的。。。是不是机器坏了？
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bluelake[使用道具]
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发表于 2016-4-8 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把所有的试剂混匀后再试一试，另，探针稀释一步要严格，稀释后分装，超低温保存，一定要避光
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2016-4-8 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是气溶胶污染吧，同一个基因做多了可能会出现。有的说是盖子没盖严，阴性曲线会很奇怪。
多通风，或者用UNG酶吧
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发表于 2016-4-8 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对第二个问题，可能是液体蒸发造成的，我们遇到过。
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发表于 2016-4-8 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
估计是气溶胶引起的可能性比较大，之前我也遇到相同的情况，然后挪到超净台去做就好多了。
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发表于 2016-4-8 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
恩 我们实验室也遇到过类似问题，即使没有模板也会出现扩增曲线；老师解释说是行实时定量的实验室充满了大量DNA
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ero11[使用道具]
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发表于 2016-4-8 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于气溶胶我已经很无奈了 我每次用台前都要用酒精在台内彻底烧一遍- -
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bluelake[使用道具]
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发表于 2016-4-8 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

遇到同样的问题，不过我是用的SYBGREEN，用水做模板都有扩增曲线，CT值在5-30不等，所有东西都换完了，操作很小心，同样的有情况，并且有个孔只加引物和MIX，也有斜行抬高的斜线，简直不知道是什么原因，不知道怎么解决！
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milkdog[使用道具]
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发表于 2016-4-8 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是斜行抬高的话，但不是S型的话，可能是由于蒸发的原因，可以考虑以石蜡油封盖试试
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