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NAR(核酸研究)上关于AS-PCR有篇文章绝对经典，做AS-PCR必须要看。1990年左右，Huang MM写的。讲的是突变检测用引物3'末端不匹配碱基错配延伸问题。错配不可以是t:t，这样即使错配也能很有效地延伸。具体情况，请自己看那篇文章，必看文章。
最好用hot start.
根据我的经验以及文献报道，50以上，升高退火温度对错配区分特异性没有多大贡献。
如果你是要做multiplex PCR，引物浓度需要摸索，先从最低开始--可以考虑0.04uM。然后看哪条带不够亮那么就增加那条带的引物浓度，0.02地望上加。
注意一定要使用Taq而不能用有extaq, pfu, pyrobest这些有3'末端外切活性的。
或者考虑采用一种全新的实验方案。
这种方法有多种称谓，除了ASPCR这个名称之外，还有：等位基因特异扩增(ASA，Allele-specific enzymatic amplification)，等位基因特异酶扩增(ASEA，allele-specific enzymatic amplification)，扩增耐受突变系统(ARMS，amplification refractor mutation system)，错配PCR(mismatched polymerase chain reaction)，聚合酶等位基因特异扩增(PASA，PCR amplifications of specific alleles)以及错配扩增突变分析（MAMA，Mismatch amplification mutation assay）等等(K·B·穆里斯 等，1997)。
错配延伸问题
在ASPCR问世时，人们就发现并非所有的错配碱基都可以有效地抑制PCR反应从而达到模板区分的目的(Newton等，1989)。然而，许多就错配延伸这个问题展开的研究结果之间，相互矛盾。
综合若干文献：引物末端与模板之间的a:a, a:g错配，可以放心地应用在ASPCR中。其他错配的情况，依据反应条件、所用试剂以及模板的不同，仍然需要具体实验来进行确定。
ASPCR的发展
ASPCR的发展，主要是围绕提高3’末端碱基错配分辨率来进行的。为了提高ASPCR对末端碱基错配的分辨力，人们尝试了许多方法。比如：改换另一条链进行分析以规避这些错配延伸率高的碱基组合；把控制PCR反应的关键成分稀释到接近极限的浓度；在检测用引物的3'末端附近人为引入新的错配；截短Taq DNA聚合酶；利用正配碱基、错配碱基掺入的动力学性质的差异，用腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)来增强这种差异，从而使信噪比大大提高；以及利用人工修饰的碱基作为3’末端碱基来抑制错配延伸率等等。
早期的改进方法
Bottema 等（1993）提出两个解决方案：一是设计引物时，如果引物3'末端可能与样品模板形成延伸率高的碱基错配，那么可以考虑以其互补链作为模板，从而避开这些高延伸率的错配。二是把控制PCR反应的关键成分稀释到接近极限的浓度。由于错配延伸效率毕竟比正配延伸要差，在扩增资源极低的情况下，错配延伸即使发生，也达不到可被显示出来的水平，因此避免了假阳性结果。但是，这两种方案都需要大量实验来对实验条件进行摸索优化，因此目前已较少被采用。
近期改进方法：
1。在3‘末端附近引入额外错配
2。腺苷三磷酸双磷酸酶介导的等位基因特异PCR法(apyrase-mediated allelespecific extension, AMASE)以及焦磷酸解激活的聚合反应法(Pyrophosphorolysis-activated polymerization, PAP)
3。AMASE
4。改进酶
5。锁定的核酸技术(locked Nucleic Acid, LNA)
