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标题:【求助】A260/A280的Ratio低与DEPC水有关么？

小螺号[使用道具]
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发表于 2016-4-9 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】A260/A280的Ratio低与DEPC水有关么？

我在做RNA提取时A260/A280的Ratio总是徘徊在1.4左右，反复找原因后发现在其他操作及条件均相同的情况下，DEPC水不同得出的Ratio也不同。
问题是：用买的两家公司的DEPC水和自己配制的DEPC水都得不到理想结果，只有用以前一位前辈用过的分装后未注明来源且所剩无几的DEPC水可以得到理想结果！！！
郁闷死我了！哪位前辈可以给我指点迷津呀？请帮帮我！！
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发表于 2016-4-9 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

消毒不严格吧？
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发表于 2016-4-9 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
A260/A280的Ratio低说明提取的RNA纯度低
加氯仿后离心的转数跟时间够不够？
还有很重要的一点就是：离心之后吸上清，中间有一层白白的东西，那一层一点点都不能吸，宁愿上清少吸一点也不能把那层吸进去了，一吸，纯度就降了。
我以前也是把上清吸得很干净，把中间那一层都吸了。纯度一直都上不去，后来同学跟我说过不能吸中间那一层之后，纯度就都很高了～
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发表于 2016-4-9 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的一个老师说RNA使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定会比较高，（我没试过，都是用DEPC水溶解和测量的） 如果用DEPC水来溶解测量，相对稍低一些，但也不至于象楼主那样1.4左右，楼主是使用得试剂盒吗？我用试剂盒提取的一般在1.7～1.9，常在1.8多，有时候还会高于2.0，但是对实验结果影响不大，如果不用试剂盒，1.3多也是有可能的，我也曾经作出过结果。一般来说，低离子强度或低pH值会使OD280值升高，估计是楼主的DEPC水出了问题吧。
另外一个原因就是样品裂解时加入的试剂量偏少，或者组织块偏大，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。
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发表于 2016-4-9 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家的宝贵意见！太感谢了！
我用的不是试剂盒提取，样品裂解时50mg左右的组织加入1mlISOGEN，不知道这个量是不是可以？
homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃，不知道这样的设置转速和时间是不是够？
吸取上清时为避免吸取中间层我用166ulpipette吸取三次，第三次时只是看上清残余情况取适量，这样应该可以排除中间层影响的可能性了吧？
如果真的是EDPC水出了问题的话我该采取什么措施呢？
请高手指教！
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发表于 2016-4-9 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
50～100mg左右的组织加入1mlISOGEN都没有大问题。
homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃还可以，只是楼主加入chloroform有没有剧烈震荡啊？这一步的剧烈振荡十分关键的，不然就可能有蛋白。
吸取上清注意了应该问题不大。
DEPC水换一个公司的试试。测OD值用的时候换新配制的试试。
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发表于 2016-4-9 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做RNA提取时A260/A280的Ratio总是徘徊在1.4左右，反复找原因后发现在其他操作及条件均相同的情况下，DEPC水不同得出的Ratio也不同。
问题是：用买的两家公司的DEPC水和自己配制的DEPC水都得不到理想结果，只有用以前一位前辈用过的分装后未注明来源且所剩无几的DEPC水可以得到理想结果！！！
郁闷死我了！哪位前辈可以给我指点迷津呀？请帮帮我！！！
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这个应该不是拫重要,比值只是一个参考,我们实验室(科技部的一个重点实验室)在做反转的时候,一般不怎么考虑A260/A280的比值.若果,你后面的实验要求很高,如建文库什么之类的话,那就要考虑这个值了!希望能对你有用.
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发表于 2016-4-9 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
260/280值低说明蛋白含量高，有可能是离心后取上清的时候不小心吸到的中间的蛋白层.可以在提取后做PCI抽提,乙醇精制来除去蛋白.
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发表于 2016-4-9 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在补充一下,还有一种可能的原因是,在测量OD的时候，调零和稀释RNA的溶液应该用TE,用DEPC确实是会使260/280高,你以前用的剩一点的DEPC可能是偏碱性,这样所受的影响比较小,但是绝对没有用TE的好.
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发表于 2016-4-9 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 101010 于 2016-4-9 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在补充一下,还有一种可能的原因是,在测量OD的时候，调零和稀释RNA的溶液应该用TE,用DEPC确实是会使260/280高,你以前用的剩一点的DEPC可能是偏碱性,这样所受的影响比较小,但是绝对没有用TE的好. ...

谢谢您的意见！
不好意思，我是新手，对相关的词汇都还没弄很明白，请问一下：TE是指？
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