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标题:【求助】A260/A280的Ratio低与DEPC水有关么?

黄花菜[使用道具]
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感觉关系不太大,关键是蛋白浓度比较高,应该是氯仿抽提的不好
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9900[使用道具]
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你到底是要干什么?是要做克隆测序?还是要做表达分析?
要是做克隆测序,比值的大小无所谓了,跑个胶看一下,如果降解不是很严重,就可以继续进行反转录和后续的PCR,没问题的;但如果你要进行表达分析的话,小心了,最好两方面都做,而且我觉得跑胶的结果更能说明问题,就如大家所说,影响OD值的因素很多,但是电泳结果是最直观、最准确的,所以建议你把提取的RNA电泳一下,根据它的结果进行判断!
祝实验顺利!
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idea2011[使用道具]
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有关系
用PE或双蒸水测会高0.1左右
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你到底是要干什么?是要做克隆测序?还是要做表达分析?
要是做克隆测序,比值的大小无所谓了,跑个胶看一下,如果降解不是很严重,就可以继续进行反转录和后续的PCR,没问题的;但如果你要进行表达分析的话,小心了,最好两方面都做,而且我觉得跑胶的结果更能说明问题,就如大家所说,影响OD值的因素很多,但是电泳结果是最直观、最准确的,所以建议你把提取的RNA电泳一下,根据它的结果进行判断!
祝实验顺利!
......

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谢谢您的意见!
我要做的是表达分析,跑过胶了,出来的条带倒是很漂亮,这样的话是不是就可以不去管OD值了?
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小螺号[使用道具]
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核酸样品的A260/A280值一般在1.7~1.9是比较合适,偏离这个值可能是由于蛋白含量偏高(A260/A280值大于2.0)、DNA样品中有RNA污染(比值小于1.7)、RNA中有机物如氯仿等污染(比值小于1.7)造成。值得注意的是:当样品中的脂肪含量较高,而使用的抽提方法又没有特别注意这一点时,比值也会偏低。DEPC水有影响,但不是根本性的问题。RNA的质量及浓度以在胶上鉴定为使用前的最终标准,以rRNA条带尖锐(sharp)且28S的亮度是18S的亮度的2倍以上为好。另外,不同组织、不同的RNA提取方法所得RNA跑胶时rRNA的条带数可能并不仅仅是28S和18S这2条,可能还有较大的条带,但与DNA的污染又明显不同,它们与点样孔的距离较远。一般来说,这样的RNA样品可能质量更好。
......

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谢谢!
我做了跑胶,出来了三条带,28S条带的亮度大约是18S条带的两倍,tRNA条带也出来了。各条带也都比较sharp的感觉。这样是不是就可以说明我提取的RNA没有大问题?
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xueyouzhang[使用道具]
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个人觉得应该没有什么问题了,但是请你还要注意,跑胶时,只有核酸能被EB结合,紫外下发出荧光,也就是说,你的胶面很干净,一是说明RNA没有降解,而是说明没有DNA污染,不过至于其他杂质,比如:蛋白、多糖等是看不出来的。但是只要你按说明小心操作污染蛋白的可能性不大,如果你提RNA的组织多糖含量不高,也不用去管了,继续做吧!
还有,这个比值还与你溶解RNA的水的PH值有关,正常我们说得1.8~2.0,是溶于偏碱性(ph7.5)的溶液中的比值,不知道你用的水的ph值是不是偏低!
祝实验顺利啊!
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可以负责任的告诉你,和DEPC水有关。
把你的DEPC水换成MILLI Q再测,OD值就会上去了,当然也不排除有一些污染。
如果你只是做RT,接着做PCR,那么你不用考虑260/280,除非里面的成分影响到逆转录的效率了。OD值只能反应纯度,并不能反映你的RNA的质量,也就是常说的RNA是否有降解,RNA的质量需要通过RNA电泳来确定,只要RNA没有降解就可以继续往下做RT了,不会影响实验结果。
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ilovegaga[使用道具]
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同意楼上的说法,我也层碰到过类似的问题,用DEPC水来测定OD值时比用TE测的值要0.3左右。如果只是进行rt-pcr,只要不影响翻转录,可以不用考虑这个值。一点个人看法
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yhtfyl[使用道具]
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感谢楼主分享,受教了
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