光谱之家

原子荧光光谱分析(AFS)是20世纪60年代中期提出并发展起来的一种新型光谱分析

技术，它具有原子吸收和原子发射光谱两种技术的优势，并克服了它们某些方面的缺点，具有分析灵敏度高、干扰少、线性范围宽、可多元素同时分析等特点，是一种优良的痕量分析

技术。

一、原子荧光光谱法的原理

原子荧光是原子蒸气在具有特征波长的光源照射后，其中一些自由原子被激发跃迁到较高能态，然后去活化回到某一较低能态(常常是基态)而发射出特征光谱的物理现象。当激发辐射的波长与产生的荧光波长相同时，称为共振荧光，它是原子荧光分析中最主要的分析线。另外还有直跃线荧光、阶跃线荧光、敏化荧光、阶跃激发荧光等。各种元素都有其特定的原子荧光光谱，根据原子荧光强度的高低可测得试样中待测元素含量。

原子荧光强度工f与试样浓度以及激发光源的辐射强度％等参数存在以下函数关系：

Jf===垂， (3—7)

根据朗伯一比尔定律：

f—Io(1一e—KLN) (3—8)

jf一垂凡(1一e—KLN) (3—9)

式中，中为原子荧光量子效率；J为被吸收的光强；Jo为光源辐射强度；K为峰值吸收系数；L为吸收光程；N为单位长度内基态原子数。

当实验条件固定时，且基态原子数近似等于总原子数时，原子荧光强度与能吸收辐射线的原子密度成正比。当原子化效率固定时，“便与试样浓度c成正比，原子荧光强度与激发光源的强度之间存在线性关系，其灵敏度随激发强度的增加而增加。但是，当激发光源强度达到一定值后，共振光的低能级与高能级之间的跃迁原子数达到动态平均，出现饱和效应，原子荧光强度不再随激发光源强度增大而增大。同时，随着原子浓度的增加，荧光再吸收作用加强，导致荧光强度减弱，校正曲线弯曲，破坏原子荧光强度与被测元素含量之间的线性关系。式(3—11)的线性关系，只在低浓度时成立。当浓度增加时，式(3—10)带二次项、三次项……，h与厂的关系为曲线关系。所以，原子荧光光谱法是一种痕量元素分析方法。

二、原子荧光光度计

原子荧光光谱法的仪器装置由3个主要部分所组成，即激发光源、原子化器以及检测部分，检测部分主要包括分光系统(非必需)、光电转换装置以及放大系统和输出装置。

三、分析方法

原子荧光光度计具有仪器参数设置、自动进样、数据显示、运算和打印，并根据设置自动完成工作曲线等多种功能的计算机控制系统。具体操作要点如下：

1．样品的预处理

在处理过程中不应造成被测元素的损失，所用的试剂必须事先检查空白。对于某些具有两性的可形成氢化物元素如Sn或Ge也可采用碱 性 发生的方式，即将样品碱熔后用水抽出，在滤液中加入KBHt溶液，然后将此溶液与酸反应发生氢化物。最终的酸度及介质要符合被测元素发生氢化物的要求。除Hg外，一般来说不要采用硝酸 或王水溶液。样品溶液的最终体积可以为25mI。或50mL。每次测定采用断续流动法时样品消耗量一般不超过1mL。

2．最佳反应介质的选择

样品处理后，必须将溶液调整到被测元素的最佳反应介质，并将高价态的元素还原为合适价态。六价的硒、碲和五价的砷、锑的测定需要分别将其预还原至四价和 fir，即S。

(VI)、Te(Ⅵ)、As(V)和Sb(V)需预还原为Se(IV)、Te(1V)、As(HI)和Sb(HI)。

除了酸度及价态外，某些元素如镉及锌需要加一些辅助试剂以促进挥发性物质的产生。

3．干扰的考虑

要成功地分析样品中某一元素必须充分考虑可能存在的干扰。液相干扰主要来自C。、Ni、Co等重金属元素，克服这些干扰的一般方法为：调高反应酸度；加入掩蔽剂；加入铁盐(Fe抖)；用断续流动或流动注射法来发生氢化物分离。克服气相干扰的一般方法为：阻止干扰元素生成气态化合物；已经发生则应在传输过程中加以吸收；提高石英炉温度。

4．工作曲线的建立

现在的原子荧光光谱仪均配有操作软件，可参考标准条件所建议的标准系列制作工作曲线。为获得最佳测量结果，可选择软件提供的各种数学模式来拟合工作曲线。具体制作时应注意以下几点：原子荧光光谱分析是一种微量及痕量分析，因而不应当用太高的标准系列，否则所得到的将是一条难以拟合的严重弯曲的工作曲线；对于组成十分复杂的样品应当采用标准加入法；大批量分析中每测定10个试样作一次标准校准，以保证测定结果的准确性

常用色谱和光谱分析方法和技术
　　色谱分析、光谱分析以及两谱联用技术，构成了药物分析学科领域中最主要和最基本的研究手段和方法，应用日趋广泛，发展十分迅速，新颖方法层出不穷。

新近常用的色谱分析方法：
一、胶囊色谱(Micellar Chromatography,MC) 又称拟相液相色谱或假相液相色谱(Pseudophase LC)，是一种新型的液相色谱技术。特点是应用含有高于临界胶囊（或称胶束，微胞等）浓度的表面活性剂溶液作为流动相。所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(Critical Micelle Concentration,CMC)时形成的分子聚合体。通常每只胶囊由n个（一般为25～160个）表面活性剂单体分子组成，其形状为球形或椭圆球形。在CMC值以上的一个较大浓度范围内，胶囊溶液的某些物理性质（如表面张力、电导等等）以及胶囊本身的大小是不变的。构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。通常有正相与反相两种胶囊溶液。前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊；后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同，并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析，是一种安全、无毒、经济的优越技术。
（一）原理：胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenous system)。在胶囊色谱中，分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用；同时定量地指出分离组分的容量因子k'的倒数值与胶囊浓度成正比，一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。
（二）方法特点：与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系，而常规流动相是一种均相体系。特点：
1、高度的选择性：因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用，只要通过流动相中胶囊浓度的改变，就可使分离选择性获得改善和提高。此外，通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。
2、便于梯度洗脱：由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时，溶液中仅胶囊的浓度发生改变，而表面活性剂单体分子的浓度不变，不影响流动相与固定相的平衡过程，因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间，并减少了流动相的消耗，适用于常规。
3、提高检测灵敏度：胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度，从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。
4、因分离组分不易分出，故缺点是柱效低且不适于制备分离。
（三）常用表面活性剂：常用的阳离子表面活性剂主要有：溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyl trimethyl ammonium bromide or chloride,CTMAD或CTMAC)；阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS)；非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。
二、手性分离色谱(Chiral Separation Chromatography,CSC)
是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异，有必要对某些手性药物进行对映体的纯度检查。
（一）原理和方法：对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外，其理化性质是完全相同的，因而难以分离。传统方法（分步结晶法、酶消化法等）有很大局限性，特别是难以进行微量分离和测定。60年代前后，TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分不多的化合物，且需要较复杂的样品处理步骤，制备分离也难以进行。80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。
　　HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
　间接方法主要基于外消旋体混合物经柱前衍生化形成一对非对映异构体(Diastereoisomers)。此法又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法。由于d-型和l-型对映体的物理性质完全相同，只能在手性固定相上才能获得拆分；如果利用对映体分子中的反应基团与某一光学纯试剂反应形成了非对映光学异构体混合物，其物理性质就有较大的差异，因而可在普通固定相（非手性固定相）上实现分离。本法需高光学纯度的手性衍生化试剂(Chiral Derivatization Reagent,CDR)，衍生化反应往往比较繁琐费时；各对映体衍生化反应的速率有时也不相同。由于可采用价格便宜、柱效较高的非手性柱和通过适当的衍生化反应可提高检测的灵敏度，以及衍生化过程中可伴随样品的纯化等优点，柱前手性衍生化的方法仍然是当前手性药物拆分、尤其是生物样品中药物对映体分离和测定的常用方法。
　直接方法主要采用手性流动相添加剂(Chiral Mobile Phase Additives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。CMPA法又可称为手性流动相(CMP)拆分法或手性洗脱法。它不必事先将样品制备成衍生物，而只须将手性剂加入流动相中。手性添加剂与样品所形成的各种手性络合物虽然不及CDR法所形成的衍生物那样牢固，但它所依据的手性识别作用和络合物的非对映异构体性质却基本相同。常用的CMPA有：环糊精(Cyclodextrins)类（主要是α-、β-和γ-环糊精及其衍生物）；手性离子对配合剂(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等；以及配位体交换型手性流动相添加剂(Chiral Ligand-exchange Complexes,CLEC)，其中手性配位体多为光活性氨基酸或其衍生物，再与二价金属离子形成螯合的配位化合物，以适当的浓度分布于流动相中，遇有药物消旋体时即可形成相应的非对映体配位化合物对，然后在正相柱或反相柱上完成拆分。近年来CSP法发展迅猛，应用日益广泛。它是不经转变成非对映体而直接拆分的方法，优点是：适用于不含活泼反应基团的化合物；除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂；样品处理步骤简单。但迄今为止，CSP柱商品已有40多种，价格大多昂贵，尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。根据分子结构选择合适的CSP柱是非常重要的。常用的CSP有：手性电荷迁移配位体固定相，如 Pirkle型HPLC-CSP；蛋白亲和配体固定相，如 Enantiopac(LKB)；内部配位化合固定相，如环糊精(Cydobond)和纤维素酯(Chiracel)等；以及配基交换固定相，如L-脯氨酸-Cu2+共价键合于聚苯乙烯等基质上。
　　CSP拆分对映体的理论概念：在HPLC的CSP柱上拆分对映体是利用药物对映体和特制的、在硅胶上键合的对映体固定相（CSP）之间所形成的非对映体复合物。由于非对映体复合物稳定性差异，可使两个对映体的保留时间不一致，与CSP形成稳定性较差的非对映体的药物对映体可先洗脱，因之实现了拆分。CSP设计是基于Dalgliesh在1952年提出的“三点手性识别模式”(Three-point chiral recognition model)，认为要实现手性识别，在手性化合物分子与CSP之间至少同时要有三个相互作用部位，其中之一必受空间影响，或是相互吸引或是相互排斥。生成的非对映体的相对强度，决定了两个对映体的分离度和洗脱次序。
（二）三类手性分离方法的比较：CDR法的优点是应用条件相对简易，只需采用普通HPLC的固定相和流动相即可而且通过衍生化有利于增加检测（紫外或荧光）灵敏度；缺点是样品中相关化合物须预先分离、衍生化手性试剂的光学纯度的高要求以及异体对的衍生化反应速率不一。
　　CMPA法的优点是不必作柱前手性衍生化；对固定相也无特殊要求；样品的非对映异构化络合具有可逆性而且利于制备。主要缺点是可拆分的化合物范围有限；某些添加剂不够稳定而且往往会干扰检测。
CSP法的优点较多，能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定，制备分离方便，定量分析的可靠性较高，采用此法研究考察的化合物已达数千种之多。缺点是样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂），对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那样广泛。
三、离子色谱(Ion Chromatography,IC)
　　是由经典的离子交换色谱发展开创而成的新的液相色谱分析技术，具有快速、灵敏、选择性好、且可同时测定多组分的优点；还能测定无机的或亲水性的有机阴离子。IC已广泛用于其他多个领域，但在医药研究中的应用尚处起始阶段。它不仅可用于药品的常规质量同时分析，也可有效地用于生产过程的质量控制和体内药物分析，具有美好的应用前景。
（后完成了分离。