【讨论帖】求电荷异构体对抗体质量的影响的讨论 - 经验共享

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标题:【讨论帖】求电荷异构体对抗体质量的影响的讨论

彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 xuuuu 于 2016-4-9 16:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、抗体分子的异质性与电荷变异
抗体分子作为复杂的四聚体糖蛋白，具有质量不均一的特点，即“异质性"。异质性可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，（如细胞系及培养工艺影响糖基化）也可能来于纯化，制剂工艺中产生降解或聚 ...

确实，除了氧化外，你提到的三种都应该是抗体负电荷增加，但氧化修饰是不确定的。它对电荷没有直接影响，只是通过改变构象，从而改变整体抗体带电量，最终是酸是碱都有文献报道。

喵咪[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据自己的经验补充一点。
有些蛋白在等点聚焦上显示不同的条带，有可能是蛋白质折叠的时候，产生了一条活动的臂，不同的折叠方向表现出来不一样的条带。对于这种现象，可以在电泳时加入一些非离子的表面活性剂如Triton X-100来去除，或者确认。

PPT[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由喵咪于 2016-4-9 16:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
根据自己的经验补充一点。
有些蛋白在等点聚焦上显示不同的条带，有可能是蛋白质折叠的时候，产生了一条活动的臂，不同的折叠方向表现出来不一样的条带。对于这种现象，可以在电泳时加入一些非离子的表面活性剂如Triton X-10 ...

您指的是等电聚焦的时候，那么在native 电泳的时候这一招是否管用，貌似是一个道理，都是构象不同引起的。
还有不是太明白，加上Triton X-100是什么作用机制呢。

喵咪[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 PPT 于 2016-4-9 16:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您指的是等电聚焦的时候，那么在native 电泳的时候这一招是否管用，貌似是一个道理，都是构象不同引起的。
还有不是太明白，加上Triton X-100是什么作用机制呢。 ...

对的，如果的确是构象差异造成折叠方向不一致，从而表现出不同条带，那也就说明了构象差异造成表面电荷的差异，又何必用Triton X-100去除这个差异呢？

喵咪[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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any333[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对的，如果的确是构象差异造成折叠方向不一致，从而表现出不同条带，那也就说明了构象差异造成表面电荷的差异，又何必用Triton X-100去除这个差异呢？

=================================================================================

消除这个差异，只是为了研究一下，这个差异是不是因为折叠不一样造成的。并不是为了消除而消除。

mamamiya[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我自己就在做这方面的研究，分别分离，在作结构和功能，，现在普遍的做法是直接在通过弱阳离子柱戴安的 propac
wcx-10 ，根据图谱，手动收集，国外也有人采用置换色谱，通量更大，效率更高

===============================================================================================================

最近，我也要做CEX 半制备柱的酸碱主成分的收集工作，由于之前用自动收集器收集后的酸碱组分在做SEC时，有的酸碱组分产生了聚合，而有的则产生碎片，鉴于以上情况出现，请问是否知晓是什么原因造成？人为因素？不知您用手动收集时是否遇到这种情况？还有，现在，我准备进行手动收集，你有什么好的建议？手动收集的时候需注意的事项可否告知一下？期待你的答复，非常感谢！！！

彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 mamamiya 于 2016-4-9 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我自己就在做这方面的研究，分别分离，在作结构和功能，，现在普遍的做法是直接在通过弱阳离子柱戴安的 propac
wcx-10 ，根据图谱，手动收集，国外也有人采用置换色谱，通量更大，效率更高

======================================= ...

最好告知你是如何处理的？洗脱之后的样品里含盐，且浓度低，我当时是通过超滤浓缩并置换到一稳定的缓冲液中。出现碎片和聚集，很可能是在浓缩过程中产生的。另外，酸性组分中本就可能出现碎片的富集，碱性组分出现聚体的富集。你可以将酸碱组分的碎片、聚体总量，与原样品碎片、聚体总量对比（注意酸碱性组分在原样品的比例）。看看是富集还是后面产生的。

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 彼岸花opp 于 2016-4-9 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最好告知你是如何处理的？洗脱之后的样品里含盐，且浓度低，我当时是通过超滤浓缩并置换到一稳定的缓冲液中。出现碎片和聚集，很可能是在浓缩过程中产生的。另外，酸性组分中本就可能出现碎片的富集，碱性组分出现聚体的富集 ...

收集得到的组分进行脱盐浓缩，然后直接上样，SEC检测,结果发现，

酸性组分产生了聚集。如何解释？

ujne[使用道具]
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发表于 2016-4-9 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

怎么证明酸性峰或者碱性峰是目标蛋白的电荷异质体而不是其他分子大小和电荷性质类似的杂质呢？仅靠SDS-PAGE或者是HPLC（SEC）能说明是单一组分吗？

现在我的问题是，我的一个蛋白，SDS-PAGE和HPLC检测结果都是高纯度的，但是等点聚焦跑出来有好几条带，而且这几条带粗细差不多，看不出哪个是主带，这说明什么呢？我的蛋白的异构体太多了吗？如果是这样的话，去报药的话，中检所的老师会提出质疑吗？我该如何解释我等点聚焦的结果呢？

入行不久，经验不多，请各个大神指点迷津~~

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