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标题:【讨论帖】关于重组蛋白生产用的细胞株构建与...

米囡[使用道具]
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1
 

【讨论帖】关于重组蛋白生产用的细胞株构建与...

您好,
看到您在论坛中的留言,有几个问题想请教一下。
1、一般情况下,反应器中的产量会比摇瓶中的产量提高多少?
2、在培养基优化过程中,一般会有怎样的指导原则?(我在优化培养基时,随意性很大没有明确目标)
3、关于大豆蛋白胨水解多肽在以后的工艺开发中会不会被淘汰掉(近10年)?
4、目前国内的抗体表达水平是多少?我们明年的任务是4G/L,不知道压力是不是很大。(今年是3g/l左右)
期待您的解答……
谢谢!
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viviwang1987[使用道具]
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2
 
1、可以出国读博士,毕业先到美国小的生物公司先做做
2、国内做培养、发酵研发可以去公司的研发机构,大型反应器如果您不是女汉子,就别去。
3、生物制药目前缺的是那种国际化的、有工作能力的年轻人,提高表达量、提高纯化收率、等给公司带来明确效益的,还有分析方法开发的人员比较抢手。
4、去合资和外企,对于研发来讲比较好,如果你是一个事业型的女孩子,如果你满足于生活的悠闲,可以去研究所,据我所知,研究所往往没有生产型企业的研发搞的更实用,往往偏理论
5、小企业或者是发展中的企业可以学习到很多,国外大企业也好,钱多,范围窄,适合没有太多追求的女孩子
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F22[使用道具]
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3
 
经战友同意,将交流内容贴出
你好,请问关于稳定细胞株所用载体问题:
1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势,相关专利大约什么时候到期?
GS相对DHFR而言具有以下几点优势:
1,细胞株筛选时间短,不需要不断的加压筛选。
2,在细胞株稳定性问题上,GS系统要更加稳定,一般稳定性培养都要做到3个月左右时间。
GS的专利好像还没有到期,DHFR的专利到期了。现在的筛选系统趋向于GS和DHFR双筛选系统,目的是集合两种优点,但效果还不确定。
2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的,用大量的稳定细胞株长期加压筛选?
细胞株克隆不稳定主要是克隆选择不好或筛选系统不好,主要偏向于前者。细胞株稳定性一般培养到两个月以后降低15%左右还是可以接受的
3、如果采用定点整合载体,如何选择?
这种方法目前常规用的可能比较少,在这方面没有经验的。一般GS或DHFR系统筛选到高表达细胞株克隆的概率是5%左右.
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glass[使用道具]
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4
 
各位大侠,我请教个很基础的问题(我主要做行政管理这一块),公司细胞培养这块的同事,每天去看发酵罐的次数也就2-3次,这个频率是不是少了点?而且主要的是细胞还养得不怎么样。


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呵呵,看的次数多少和细胞养的好坏没有必然联系的
所以做管理的不要从看发酵罐的次数来做判断,看的次数多少和你的管理工作没有关系,可以随他去
细胞养得好不好才是你该关心的事情,养得不好可以说,可以提,但是不能从看多少次发酵罐来入手
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1、关于乳酸的控制控制有哪些比较好的策略,根据以往的经验就是就是降低糖浓度,结果是有的时候管用有的时候不管用,对于下面的工艺开发就比较头疼了。
2、能否推荐一下关于反应器及工艺优化方面的介绍书籍,增加自己对这方面认识。
再次谢谢您
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米囡[使用道具]
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1.我个人的经验的,反应器产量有了过程参数的精确控制(pH/DO/temp),流加方案的优化,关键代谢指标的控制(糖、乳酸、谷氨酰胺、氨),应该有较大幅度的提高(30%),当然这个是case by case的,不能一概而论,更多的依赖于细胞株潜力和平台化的培养工艺开发效率。
2、培养基优化的常规方法与思路(参考《用于重组抗体生产的细胞大规模培养工艺开发》)
3、不仅大豆水解物,还有小麦水解物,酵母水解物,肯定是要淘汰的。这些添加物本身成分不明确,质量不可控。培养基的发展方向是CD,即化学成分明晰。
4、目前国内新上项目应该在2g/L左右。 如果不考虑具体的品种,市场容量对产能的要求。个人感觉4g/L没有必要。 重组抗体的产业化工艺开发不仅是细胞培养这一个环节。TITER过高对于下游的压力。对于产品质量的影响,都应该考虑。
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米囡[使用道具]
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7
 

1)控制乳酸,
首先应考虑葡糖糖的限制性流加策略,即根据细胞的葡萄糖消耗速率进行培养基流加。考虑到葡萄糖浓度控制过低(<1g/L)时,培养基中其他营养成分可能消耗殆尽,一般残糖的控制水平可以控制在2-5g/L左右。
目前商品化的培养基及流加策略,都有可供参考的protocal,可以直接在此基础上进行工艺优化。
文献中报道的乳酸阈值(影响细胞生长、抗体质量的乳酸浓度)58mM,l流加培养操作模式下,一般很少能达到。
其次,细胞培养工艺中pH的控制,对乳酸的生成也有影响。一般情况下,pH控制高,即偏碱的环境是刺激细胞产酸的。所以一般表达重组蛋白的培养工艺中,生产期的pH要控制的偏酸性。
最后,溶氧不足也会造成细胞无氧呼吸,代谢产酸的。
至于报道的使用半乳糖替代葡萄糖,不做推荐。
2) 细胞培养的参考书籍
推荐hu weishou 《Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies》google可以查到免费电子版本。
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yes4[使用道具]
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8
 
学习了!另外询问一个问题,反应器中溶氧不足是培养过程中某个特定阶段的问题呢,还是会伴随整个培养过程一直出现?
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米囡[使用道具]
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9
 
以下是个人浅见,未必正确,仅供参考。
1、溶氧需求是个变化的过程
完整的细胞培养过程(无论batch、Fed Batch还是Prefusion)中溶氧的需求应该是一个变化的过程。
因为,从细胞接种后,发酵罐的细胞总数、代谢活力会逐渐增加。此时耗氧量会逐步上升。当进入蛋白表达期后,通常由于降温的作用,细胞进入稳定期不再增殖,耗氧量日趋平缓,甚至下降。
以上过程,如果使用三角瓶或简单的一次性反应器(如WAVE 20/50)批式培养,溶氧值的变化,会更为直观的体现出来:先下降后稳定,最后稍显升高。
2、DO的绝对值不重要、DO的变化才是关键
动物细胞对氧气的比消耗速率可以认为是个常数(当然也受代谢的影响),目前产业化流加培养的细胞密度1-2*10E7/ml,与微生物发酵的细胞密度相比(酵母、大肠等),存在数量级的差距。因此,一般情况下,溶氧的需求不是细胞大规模培养的限速步骤。对于灌注培养,虽然细胞密度相对较高(N*10E8/ml),溶氧需求也可以通过通入空气、氧气的混合气体来满足。
以上这些,只要在发酵罐上设定溶氧控制范围,保证氧气钢瓶有足够的分压,便可通过反应器期内部的PID程序实现DO的精确控制(一般60~80%)。
值得注意的,DO的剧烈波动会影响细胞的活性、产物的质量。前者是笔者有经验之谈。后者可见大量文献报道,DO对糖基化程度的影响。
3、回到初始问题,培养过程中溶氧不足。我觉得是否可以先从反应器上找原因
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米囡[使用道具]
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经战友同意,公开问题:
您好,我看了您的几个帖子,觉得您非常厉害,很是佩服。因为面临毕业找工作处于迷茫期,因此想请教您几个问题:
1. 我14年硕士毕业,生物化学与分子生物学,女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养,主要是我是女生,觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。
2. 在生物制药中有很多的环节,比如细胞,蛋白表达,纯化,您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔(10年以后可以进入高层)
3. 是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好?我想象中大企业只能接触到某一小部分,小企业是不是可以学到更多的东西,不知道对不对。
很期待您的解答,您的解答决定着小女子的方向。谢谢您。期待。。。。
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