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把以前回答战友的帖子,也放在这里:
有一个问题请教各位,在国内的实际生产中,提高抗体产量、改善抗体质量更主要是依赖工艺优化呢,还是寄希望于细胞株、培养基的改良?或者更直白一点,药厂老总更青睐于手下人用哪种方式来优化抗体生产?
请大家不吝赐教
谈下自己的认识:楼主的问题很具代表性。无论是做biosimilar,还是其他重组蛋白药。大家最关心的是往往是三个方面, 蛋白表达量(title)、质量(quality),还有就是进度。
1、Title,细胞培养过程中蛋白的表达量是由单个细胞的产物比生产速率(Qp),活细胞密度(IVCD)以及培养时间(Time)三者决定的。即 Title=Qp*IVCD*Time
Qp代表的是细胞异源表达重组蛋白的能力,它是细胞系构建过程中初筛、复筛的主要技术指标。目前行业内能够用于产业化生产的细胞系,Qp一般可以达到20pg/cell/day以上。 构建的细胞是否能够达到这个水平,一般取决与空宿主、载体、筛选通量,筛选策略。
IVCD活细胞密度和Time培养时间,一般是初筛得到的重组细胞进行培养基优化、工艺开发时,主要考察的指标。目前行业内细胞使用商品化的培养基(Gibico/hyclone等)悬浮细胞密度一般可达1-3*10E7/ml,生长期5-7day,维持期10day以上。此步为细胞培养的工艺开发,需要借助三角瓶、深度孔板、小型反应器等进行培养基筛选、工艺参数优化。
所以,细胞的表达能力一般是细胞系构建工程中就已经决定了。而细胞的培养密度、培养周期则需要在培养工艺开发中进行优化。两者都做好了,抗体的产量自然就有了保证。
接着谈下质量。
抗体作为四聚体糖蛋白,其生物学活性有赖于其完整的结构和恰当的翻译后修饰。某种角度上说,重组抗体的工艺优化,尤其是做similar,质量比TITER更为重要。
目前重组抗体的制备是采用动物细胞异源表达。其制备工艺中无论是克隆筛选、细胞培养还是纯化工艺都会都抗体的质量造成影响。克隆筛选的常用策略是根据蛋白表达量去挑选高表达克隆。这样就会造成表达水平高、但是存在质量变异的克隆会进入下一轮复筛。但是,在克隆筛选环节考察产物的质量,需要借助高通量的分析设备。细胞培养过程中无论是培养基、培养工艺(PH/DO/TIME),甚至搅拌桨的设计都会影响抗体的质量。另外,纯化、制剂过程中,涉及到的buffer条件不恰当也会造成蛋白聚体的产生。
目前重组抗体工艺开发中,经常关注的几个质量指标有
1、分子量,
2、纯度,即,单体、大分子物质(聚体)、小分量物质(降解)的含量
3、糖基化修饰(寡糖类型及分布,如GO/G1F/G2F/MAN5等
4、等电点。