【讨论帖】生产用动物细胞的传代稳定性实验 - 经验共享

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标题:【讨论帖】生产用动物细胞的传代稳定性实验

bohe221[使用道具]
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发表于 2016-4-11 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上，非常感谢您的回答，十分受益！但是第一个问题还是不明白，怎么通过生产周期确定该做多少代次呢？假如生产周期一个月，如果三到四天传代一次，也就十代左右，会不会太少啊？

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2016-4-11 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为了生产项目的可靠性建议你做生产周期的两倍稳定性时间，这样可以看出细胞株表达量的一个变化趋势。细胞株会随着传代的时间变化呈一个下降趋势的。

any333[使用道具]
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发表于 2016-4-11 11:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

国内做的五花八门的，各种都有，关于传代稳定性方面也不是特别规范。

any333[使用道具]
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发表于 2016-4-11 11:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

传代稳定性或者终末端细胞稳定性指标可以探讨一下，可以间隔进行一些指标的检测，例如0、10、20、30、40、50之类
遗传稳定性：顾名思义就是遗传物质在。
非整合型的，质粒（目的基因和抗性存在、国外还对质粒拷贝数检测），并且目的基因序列是正确的。
整合型的，整合位点、拷贝数、目的基因完整性即不缺少、没插入（Southern/Northern）、目的基因序列及多位点整合时mRNA序列正确。
细胞表型稳定性：形态没变、生长速率没变。
产物稳定性：产量不低于多少、或者活性不低于多少。
有几点想和向大家讨论的：
1，国内很多都习惯采用传一次算一个代次，passage number来算，国外看到许多品种是按倍增来算的即generation number来模拟或者考察的，我们是两个都做，想看看同行一般如何计算的？如果是传一次算一代（passage），那如果规定一代的培养时间比较科学，尤其是大肠杆菌类的发表文章，有人6h、有人12h，比较乱。如果采用generation模拟倍增，如何更科学一点，必定在小的摇瓶里进行模拟与反应器有较大差别。
2，表达产物稳定性，多少能接受，如何规定比较科学，有同行规定不低于原始细胞株的产量的70-80%，但是我想说的是做稳定性一般都是摇瓶模拟的，每次产量就不同，波动比较大，那就不好说多少代是原始的70-80%，能否像我说的就规定不低于多少即可。从我上传的文献可以看出不同点的specifica productivity范围挺大，如何表示更科学一点，也许你原来定的原始的表达量为10mg/ml，之后可能某次都15mg/ml了。所以想知道大家是如何规定产物稳定不稳定的。

911[使用道具]
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发表于 2016-4-11 11:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Cell Line Stability Evaluation
Cell line stability is a critical factor for process scale up. For large-scale commercial manufacturing, cell lines routinely grow for over 25 generations to achieve high-density culture in the 10,000-20,000 liter production bioreactor. Studies to determine cell line stability are performed up to 50 generations. Best performing cell line will be propagated in small suspension culture and scaled to the 5-L bioreactor at interim time points to evaluate cell growth and product yield and determine long-term cell line stability.
另外有一个文献“
Determination of Chinese hamster ovary cell line stability and recombinant antibody expression during long-term culture.”
找到的可以共享下

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发表于 2016-4-11 11:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

@木木@[使用道具]
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发表于 2016-4-11 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞库一般有主细胞库和工作细胞库，想知道一般企业现在的做法是如何规定主细胞库的代次的，是第几代，工作细胞库是第几代，之后限传代次是怎么做的。这个是细胞库里规定的东东，需要明确的。
从研发角度来考虑，筛选的候选单克隆或亚克隆细胞就需要进行稳定性考察，即在建库之前就要先做传代稳定性考察，如果稳定的，才能建库，这一部分工作一般放在几号资料中，8-2号资料中吗。
8-3号资料专门是种子库及传代稳定性资料，工作种子库的传代稳定性及限传代次是放这里的吧？想交流的是候选细胞要进行传代稳定性考察，工作种子库也要进行传代稳定性考察，这两个一般是如何进行的，各做各的，还是类推，例如候选细胞到主细胞库是几代，主库到工作库是几代，工作种子库余下多少代即为限传代次，还是工作种子库重新做传代稳定性，不考虑前面的代次。
......

===============================================================================================================

28号令里，8号资料分了四部分，但是，好像也没明确说非要分出四部分来吧。至于建库，可不可以选出单克隆之后，直接就建原始库，然后建主库和工作库。建好之后，再对各个库检定，这样的话，稳定性考察，就考察工作库就行了，如果工作库没问题，那主库就更没问题了吧！
至于代次，微生物大部分还是passage number，动物细胞generation number。2010药典也说过，二倍体细胞龄以细胞群体倍增（population doubling）计算，传代细胞系则以稀释倍数进行传代，每传一次算一代。
如果每传一次算一代，那生产的时候，最终到了发酵罐，连续补料培养一个星期，这算是多少代呢？好像在摇瓶里根本就没办法模拟吧！
如果按照倍增数量算的话，大肠杆菌或者酵母，最终的浓度都很高，按湿重计算的，而且发酵后期湿重不怎么增加了，甚至会下降，那这个传代次数怎么算？
而且，如果在摇瓶里，按照没转一次算一代，那要不要加抗生素呢，生产上发酵罐里肯定不能加？

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发表于 2016-4-11 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

28号令里，8号资料分了四部分，但是，好像也没明确说非要分出四部分来吧。
----------------------这个最好按照他们的思路来，否则看资料不方便，我们当时就放的位置不对，他们说我们没有，我们说有，他们就不耐烦。
至于建库，可不可以选出单克隆之后，直接就建原始库，然后建主库和工作库。建好之后，再对各个库检定，这样的话，稳定性考察，就考察工作库就行了，如果工作库没问题，那主库就更没问题了吧！
------------------单克隆评估过后，考虑建原始库，研究阶段会有很多单克隆，需要评估每个克隆的情况的。
------------------检定各个库都要做，关于稳定性，保存稳定性每个库都要跟踪，制定方案的，关于传代稳定性，在评估每个克隆的时候就要评估，后面的工作库肯定要评估的。
至于代次，微生物大部分还是passage number，动物细胞generation number。2010药典也说过，二倍体细胞龄以细胞群体倍增（population doubling）计算，传代细胞系则以稀释倍数进行传代，每传一次算一代。
-----------------------这个出处及依据在哪里，细胞的用generation的多，但是搞不清楚为什么微生物用Passage来标示。
如果每传一次算一代，那生产的时候，最终到了发酵罐，连续补料培养一个星期，这算是多少代呢？好像在摇瓶里根本就没办法模拟吧！
----------------------这个就是要摇瓶中模拟倍增数而已，必定是模拟倍增数，不能说非要做到罐子那么高密度。
如果按照倍增数量算的话，大肠杆菌或者酵母，最终的浓度都很高，按湿重计算的，而且发酵后期湿重不怎么增加了，甚至会下降，那这个传代次数怎么算？
-------------------------就是OD简单换算过来是多少倍增数（2的N次方），不是特别科学，也没别的办法，和细胞换算generation一样。
而且，如果在摇瓶里，按照每转一次算一代，那要不要加抗生素呢，生产上发酵罐里肯定不能加？
-------------------------不加抗生素的，或者种子活化加抗生素，后面模拟发酵罐的时候加。

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发表于 2016-4-11 11:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

＂------------------单克隆评估过后，考虑建原始库，研究阶段会有很多单克隆，需要评估每个克隆的情况的。
------------------检定各个库都要做，关于稳定性，保存稳定性每个库都要跟踪，制定方案的，关于传代稳定性，在评估每个克隆的时候就要评估，后面的工作库肯定要评估的。＂
传代稳定性，在挑单克隆的时候就要评估。一般，单克隆我们就是摇瓶验证一下，并未做过稳定性，你所谓的评估是怎么个评估呢？而且我想说，我把每个库都建好之后，再去验证，合格就用，不合格就废弃。这样可以吗，而且一般来说工程菌还是比较稳定的，不会有太大的问题。尤其是现在项目比较紧张，有时候很难有时间按部就班的验证之后才小试，中试、生产。
-----------------------这个出处及依据在哪里，细胞的用generation的多，但是搞不清楚为什么微生物用Passage来标示。
[img]http://res.dxycdn.com/upload/2015/07/01/57/WaDuWf78.png!640[img]
这是2010药典三部，描述的是动物细胞。
附件为ATCC和USP中，关于检定用菌株的传代表述，中国药典好像也有类似的表述。目前我好像没见过药典中有对生产用工程菌具体传代的描述，大部分都归结到；菌毒种；，所以，在这方面，大家有什么信息，还得相互交流。

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小中大

另外，麻烦咨询一下，种子库检定中的电镜检测，是指的扫描电镜还是透射电镜。谢谢

附件

2016-4-11 11:30

91731441.snap.jpg (189.41 KB)

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