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标题:[求助]胰岛素的含量测定（HPLC）

马大牙[使用道具]
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发表于 2011-11-15 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]胰岛素的含量测定（HPLC）

[求助]胰岛素的含量测定（HPLC）


各位老师，我现在按照10版药典上的含量测定方法进行测定，结果很不理想，胰岛素的检测波长214nm，流动相是硫酸钠缓冲盐和乙腈（74:28），如果按照这个比例，出来的峰型不合格，峰太宽，理论塔板数不到2000，我现在把比例调到70:30，峰型是合格了，但是峰跟水的倒峰连在一起了，我是真的不知道胰岛素含量该怎么测定了?还有一个问题，硫酸钠需要用色谱级的吗？我现在用的是分析纯的

需要各位老师的指点，谢谢大家了
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发表于 2011-11-15 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个问题，我有发言权，我目前在做这方面的研究，对于你第二个问题，我认为不需要用色谱级的，分析纯的就可以了，我用的也是分析纯。其次，色谱条件也不需要做改变。你可以更换下色谱柱，先按药典要求，考察下系统使用性。最后，我想说的是胰岛素对流动相极性大小非常敏感，柱温对其保留时间也有很大的影响。

我目前做出来的峰型很好，拖尾因子约为1.1
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 小中大
你的流动相是按药典要求配制的吗，水相ph是2.3吗，水相和乙腈的比是74:26？
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发表于 2011-11-15 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先谢谢你回复我的帖子，我看到希望了，嘻嘻。。。我是按照药典的方法配制的，胰岛素是太敏感了，我做了好长时间才稳定下来，我用药典的比例，做出来的峰是符合正态分布的，但理论塔板数都在2000左右，不合格，所以我才考虑加大有机相的比例，让保留时间提前，我用的是安捷伦的高效液相色谱，请问您的保留时间是多少分钟啊？还有你用的哪一型号的柱子啊？我要找到原因，然后向导师申请换柱子，要不然真的要疯了。。。谢谢了
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 小中大
不同的柱子以及柱子长短，主峰出峰时间是不同的，你把你的实验条件色谱条件以及按照什么药典告诉我，我帮你分析。我目前做的胰岛素峰型很好，塔板数在6000以上。你说的理论塔板数不合格，你是根据什么标准来判断说塔板数2000，就是不合格的，据我所知，判断胰岛素的系统适用性是否合格，好像没有理论塔板数的要求。你说的塔板数在2000左右，只能说效果不好，条件不太适合，有些时候，不是说保留时间提前了，塔板数就一定会提高，不能这么绝对。同样的是胰岛素，保留时间在12min左右和在30min左右时，塔板数就差别很大，用的是同一色谱柱，你可能会认为12min时塔板数高，事实情况，正好相反。12min时，塔板数才4000不到。
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 小中大
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 小中大
这是系统适用性的图谱
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 小中大

柱：C18型号的
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 小中大
我的色谱条件：Hadera OSD-2 C18液相色谱柱（259mm×4.6mm,5um)

流动相：流动相A0.2mol/L硫酸盐缓冲液

流动相B乙腈（A:B=74:26)

柱温为40℃；检测波长为214nm,进样20ul. 这是2010版药典第二部规定的色谱条件

我的出峰时间3.4min，我没有什么依据来确定理论塔板数，只是理论塔板数低了，分离的不好并且峰型也特别难看啊，药典一般规定理论塔板数在2500以上，所以也想这么要求自己也能达到这个条件。我所说的出峰时间越快理论塔板数越高，是因为我做出来就是这样啊，还有如果我的胰岛素峰在6min以后出峰的话，理论塔板数就是1000-2000左右，所以真的是疯了，不知道该怎么办了，请帮帮我吧
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