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标题:[讨论贴]单细胞凝胶电泳技术及应用讨论

abc816[使用道具]
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回复 #70 loli 的帖子

吖锭橙就可以了,一般是20微克每升,效果很好的.
EB有毒呀!
吖念"a"不是"ya",呵呵.
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我想问一叶老师:我也是用CASP分析彗星的,但结果按您指点的方法存后,在打开只有分析的指标而没有数据,麻烦您将具体一点好吗?
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中国特色[使用道具]
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1.实验中所使用的载玻片是不是一定要那种frosted slide,用普通显微镜使用的那种透明的载玻片可不可以?
2.实验中使用的盖玻片是不是就用那种小个的正方形的普通盖玻片就可以?
3.在染色后观察时是不是不用在用清水冲洗了,从染色液里拿出直接盖盖玻片观察?
4.电泳时的电压文献里说法不一,这个电压的选择有什么标准?需要电泳多长时间
5.我不是学生物的,对显微镜不太熟,就用过那种最简单的,彗星实验里需要用什么样的显微镜,好像如果用visual scoring,就是肉眼定等级那种就用普通的显微镜照相就行了是吧,是不是得用专门的能往上装相机的显微镜啊?如果要用软件分析的话,好像还得有滤光片之类的,是不是还得有激发波长之类的需要调的参数,谁给介绍一下,另外这种分析软件是不是都是显微镜自带的分析软件,还是把图像弄下来有第三方的分析软件?
6.如果用EB染色的话,需要泡在EB里吗?还是往上滴染色液就行了?观察时用什么光谱条件?

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1.普通的那种光滑的载波片不大好用,主要是容易脱片。所以很多人都用磨片的玻璃。如果你不想用磨片的玻璃,也可以自己设计,象楼主那样。我在晶美买过一种做彗星实验的试剂盒,玻片上不知涂过什么冬冬,很好用,只需要铺一层低熔点胶,不掉胶。缺点是太贵,只能一次性使用。
2.盖玻片还是用大一点的,22mm×22mm的那种规格,可以把胶铺得更匀更薄一些,还容易取下来。
3.这个问题帖子里已有讨论。
4.具体得电压电流真的还需要自己摸索的,各种细胞各个仪器应该有所不同吧。电流100mA-300mA,电压0.5-1V/cm,电泳时间10-40min,我有见过做60min的。
5.如果想用荧光染的话,就用荧光显微镜来观察。要用普通显微镜来看,就得银染。摄像装置的目的是要把结果保存下来做分析用。有好几款软件可以用来分析。除了楼主推荐的这一款外,丁香园FTP上有一款comet5.0的,也不错。
6用EB染,不用泡,滴上去就行,泡的污染太大。弄的到处都是。用荧光显微镜的绿光来看。
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windy+++[使用道具]
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请战友指教comet assay,是测定凋亡的。


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windy+++[使用道具]
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还有一张结果,可能不太好。


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windy+++[使用道具]
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我用CASP软件分析了一下,但不知道分析出来的值是否有意义?


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园丁##[使用道具]
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关于comet-fish。其实fish 技术就用于检测染色体上具体的基因。这个基因对损伤的敏感性一般要比其他的强。现在最热门的就是检测tp53基因。而且通过这种检测。可以确定更多对人体有害的环境因素。有兴趣的话可以看看下面的摘要:In addition to exogenous risk factors, the development of head and neck cancer is based on genetic alterations and individual
sensitivity to mutagens. The DNA-damaging effect of xenobiotics and the location of chromosomal changes warrant further
investigation. The aim of this study was to evaluate variance in structural genetic changes in human epithelia as target cells for
head and neck carcinogenesis. The combination of the single-cell gel electrophoresis (Comet) assay with the fluorescence in situ
hybridization (FISH) technique is presented to examine differences in sensitivity to DNA-damage induction and in alterations
of chromosomes 1, 3, 5 and 8 in patients with and without squamous cell carcinoma of the oropharynx.
Macroscopically healthy biopsies from the mucosa, taken at a distance from the tumor of 10 patients with oropharyngeal
carcinoma and from 10 patients without tumor were harvested during surgery. Cells were isolated by enzymatic digestion and
incubated with benzo[a]pyrene-diolepoxide (BPDE), causing DNA-adduct formation by covalent binding of BPDE with DNA
bases. The cells were subsequently analyzed by means of the Comet assay to separate DNA fragments and to visualize the DNAdamage.
A hybridization mixture with whole-chromosome paints for Chr1, Chr3, Chr5 and Chr8 was added. After fluorescent
staining, the entire DNA and the DNA of chromosomes 1, 3, 5 and 8 were evaluated by digital analysis.
BPDE caused significant DNA damage in oropharyngeal mucosa cells of patients with and patients without carcinoma.
No differences in the amount of DNA damage could be observed between patients suffering from sqamous cell carcinoma
and patients without malignancy. Evaluation of chromosomal alterations, however, revealed significantly higher damage levels
in chromosomes 3, 5 and 8 compared with chromosome 1 in tumor patients. In contrast, for patients without oropharyngeal
carcinoma no differences in chromosomal alterations could be observed.
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一叶[使用道具]
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loli 战友,您好!
1、如果不自制电泳槽的话,最好用毛玻璃,我前面讲过自制微电泳槽的方法,我会尽快按照您的要求拍一张我自制的电泳槽照片,仅供参考,不过我觉得很实用。
2、我铺胶时不用盖片,所以我不清楚用什么盖片,估计就是普通盖片。“老王卖瓜,自卖自夸”,我还是向您推荐我讲过的自制微电泳槽的方法,会省去很多时间的,不信就试试,呵呵。
3、我不清楚您用什么染液,我是用EB的,电泳后,直接在胶板上滴上一滴,然后用水冲洗,用滤纸吸去多余水分,荧光显微镜观察。
4、电泳的电压问题,我在前面的帖子已经谈到过,虽然文献说法不一,但是相差也不是很大,有一篇文献专门讲了SCGE的最适条件,可以参考一下,如果您手头没有,我可以提供。
5、显微镜要用荧光显微镜,如果没有专门的彗星分析系统硬件(价格比较昂贵),最好用数码相机拍下来,然后存入计算机,用CASP软件分析。这个软件可以在网上直接下载,我在前面的帖子已经提供了。
6、如果染色时把标本泡在EB里,我觉得那是很不明智的,那样很容易污染操作中所用到的硬件,甚至自己的双手,不易防护,只要用1ml注射器在胶片上滴上1-2滴就可以了,然后用水冲洗一下,滤纸吸干(前面已经讲了)。
7、我做小电泳槽的目的主要是防止脱胶,而且不用盖片,从来没有遇到过脱胶的问题。
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一叶[使用道具]
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列解液的配制和光谱条件稍候我会给您提供详细的资料。
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一叶[使用道具]
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abc816战友,您好
文件格式的转换非常简单,用ACDsee就可以了,可以批量转换,现在的版本好像到了7.0,它的工具栏有“转换文件格式”,很方便的。把要转换的图像文件选中,然后找到“转换文件格式”,OK! 一次可以转换很多图像文件,很方便,而且还有批量改变文件名,改变文件大小等等。(如果一个一个转换,那岂不是很惨!我好像分析过了上万张彗星图像,一张一张转换的话,我早累死了,呵呵)。
我用CASP前详细阅读过它的说明,我觉得最好还是用它默认的条件为好。
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