细菌微生物检测

吉林省前卫医院     庄华君，杨旭，金映川

传统的微生物分离、鉴定方法操作繁杂，周期长，准确性差，灵敏度低，对实验室技术人员的专业技术、操作技能、工作经验要求极高，快速和准确获得细菌的鉴定及药敏结果是非常必要的。近年来随着计算机的发展及广泛应用，微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。先后出现了许多全自动细菌鉴定与药敏系统，比如VITEK 系统、MicroScan WaikAway系统、MicroScan AS-4 微生物分析仪、PHOENIXTM 系统等。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性,在很大程度上提高了工作效率，但同时也应注意一些问题，本文对几种常用的鉴定系统在临床微生物检验中的应用情况做一综述。

1、全自动微生物鉴定系统的基本原理

       全自动微生物鉴定系统是基于生物信息编码（数码）鉴定细菌的新方法。数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。
       鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。
       药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

2、VITEK 系统

       VITEK系统是由生物-梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240、VITEK 2 。由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。可以鉴定革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性球菌、酵母菌、需氧芽孢杆菌、厌氧菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌、非发酵菌等，并可进行药敏检测，对提高工作效率起到了很大作用。

       因仪器细菌鉴定是用数值分类法，它遵循的是各个生化反应“等重要原则”进行分类。而传统分类法的原则是将细菌的基本性质分为主要和次要。如果仪器鉴定结果标准化百分概率很高，而主要的生化反应不符合，它结果的准确性就值得怀疑，必须用手工试验做主要试验加以证实，否则会得出错误的结论［1］。利用VITEK专用药敏卡，可以在菌株鉴定的同时检测药物敏感性。目前已有国内文献报道检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的方法比较［2, 3］。周铁丽等用纸片扩散确证法和VITEK-AMS 专用药敏卡GNS-506 对临床分离的204株大肠埃希菌和70株肺炎克雷伯菌进行ESBLs检测，其敏感性为77.6%,存在比较严重的假阴性,与国外报道VITEK-AMS 检测ESBLs 敏感性为99.5% ［4］不符。认为现有的VITEK-AMS专用检测卡虽然操作简便,特异性好,但灵敏度较低,适用于国内医院检测ESBLs［5］。

3、MicroScan系统

       MicroScan系统有由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16～18h，快速板测定只需2～3.5h。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17～33种抗菌药物的MIC值。

       为探讨自动微生物分析仪对临床常见病原菌鉴定结果的准确性,李忠新等用MicroScan 微生物分析仪对临床分离的139 株病原菌进行鉴定并与API 鉴定系统的结果进行比较,以传统手工法作参考标准。结果表明，MicroScan 分析仪对常见病原菌鉴定结果与API或手工法符合率在79.1%～100%之间,非发酵菌鉴定的符合率最低,与文献报道［6］一致。非发酵菌鉴定符合率低的原因可能与生化反应试剂不稳定、细菌在反应板中生长不充分、细菌代谢能力差等因素有关。因此,在使用MicroScan 分析仪进行非发酵病原菌鉴定时,需要时可增加必要的手工试验,以提高实验结果的准确性［7］。据西班牙报道，临床通过MicroScan分离的55株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）经过双向PCR mecA基因检测证实，有5株为错误的病原分型［8］。利用药敏复合板同样可以进行诱导β-内酰胺酶的检测，能较好地补充常规药敏试验对细菌耐药表达的不足,使实验室的药敏结果更符合临床实际,更能准确地指导临床用药［9］。

4、PHOENIX 系统

       PHOENIX 系统是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统，由BD公司生产。鉴定试验采用 BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色（Chromogenic）反应双重标准进行药敏试验结果判断。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰氏阳性菌139种、革兰氏阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种可供选择。每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3～6 h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4～6h内出结果。

美国疾病预防控制中心分别采用纸片扩散法、Etest、MicroScan WalkAway、BD Phoenix、VITEK、VITEK 2与肉汤微量稀释法做对比，检测50株葡萄球菌、50株肠球菌的耐药性［10］，结果显示，类别一致性：MicroScan最高（96%），其他方法依次为：VITEK 2（93.0%）、 Etest（90.0%）、Phoenix（89.6%）、纸片扩散法（88.0%）、VITEK（85.9%）；MIC符合水平：MicroScan（99.0%）、Phoenix（95.8%）、VITEK 2（92.0%）、Etest（92.0%）、VITEK（85.9%）；葡萄球菌主要错误率：VITEK (35.7%)、 Etest (40.0%)、制片扩散法(53.3%)，肠球菌主要错误率VITEK（20.0%）。

       自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止 ，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

参考文献

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［2］孙长贵, 陈汉美, 颜秉兴, 等. 评价三种筛选方法检测超广谱B2内酰胺酶及其临床应用［J］. 中华医学检验杂志,1999, 22 (4) : 228-231.
［3］徐春英, 金岩, 王澎, 等. 三种方法检测超广谱B2内酰胺酶敏感性比较［J］. 中华医学检验杂志,1999,22(6):355-357.
［4］Sanders CC, Barry AL , W ash ington JA , et al. Detect ion of extended -spectrum - beta - lactamases-producing members of the family Enterobacteriaceae with thevitek ESBL test ［J］. J Clin M icrobiol,1996,34(12)：2997-3001.
［5］周铁丽, 李超, 温秀姝，等.VITEK-自动微生物鉴定仪检测超广谱B-内酰胺酶的结果评价.上海医学检验杂志，2001，16（5）：275-276.
［6］Sung LL , Yang DL , Hung CC , et al. Evaluation of autoSCANW/ A and the Vitek GNI + Auto Microbic systemfor identification for nonglucosefermenting gram negative bacilli［J］ . J Clin Microbiol ,2000 ,38：1127-1130.
［7］李忠新, 周小梅, 李伟雄，等.MicroScan AS24 自动微生物分析仪鉴定139 株常见病原菌结果分析.上海医学检验杂志，2003，18（2）：86.
［8］Wilson MS, Otth CL, Medina GS，et al. Genotypes of Staphylococcus aureus strains with methicillin resistant phenotype. Rev Med Chil. 2007，5，135(5):596-601.
［9］蓝海丽,孙伯良.全自动微生物鉴定分析仪检测诱导β-内酰胺酶的临床应用.中华医院感染学杂志，2002，12（2）：155-156.
［10］Tenover FC, Williams PP, Stocker S，etal. Accuracy of six antimicrobial susceptibility methods for testing linezolid against staphylococci and enterococci. J Clin Microbiol. 2007 ，9，45(9):2917-2922.