细菌微生物检测

一 概述
从微生物的发现到目前可以用现代化设备对其进行分离、鉴定，期间经历了几百年的发展历程。1673年，Leeuwenhock发明第一代显微镜，并观察到尿液与水中的微生物；1880年，郭霍氏（Koch）发明了固体培养基；1914年，Difco 公司发明了粉末装的培养基，使微生物的培养与鉴定成为可能。
传统的微生物培养、鉴定方法主要是利用试管或平板培养基方法。从20 世纪70年代后，微生物分离鉴定技术有了革命性的突破，自动化设备出现并得到快速发展。特别是近年来，以应用数码分类技术为基础所研发的微生物培养、鉴定设备，以及采用商品化和标准化的配套微生物鉴定和药物敏感试验卡或条板，可以对临床数百种常见微生物进行分离、鉴定和药敏试验，并在临床广泛应用。

二 微生物分离鉴定自动化仪器的发展
临床微生物自动化主要分为两个阶段：传统的微生物鉴定和现代微生物鉴定。传统的微生物鉴定是通过微生物本身的代谢来鉴定其存在或不同的种属；现代微生物鉴定主要是通过检测病原微生物的核酸或蛋白质确定其存在或不同的种属。

1. 传统微生物鉴定自动化系统
传统的微生物分离鉴定的自动化系统，又可分为两类：一类是检测临床标本中是否有细菌存在；另一类是通过将分离的细菌进行生化试验等手段加以鉴定并进行抗生素感受试验。

a. 检测临床标本中细菌的自动化系统
检测临床标本中细菌的自动化系统，多应用于血液及无菌体液的培养，即目前临床广泛使用的自动化血培养系统。



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第一代血培养仪器诞生于20 世纪70年代初，Johnston Laboratories（现为Becton Dickinson，BD）公司生产了世界上第一台血培养检测仪器BACTEC 225 系统。此后不久又推出了BACTEC 301 和BACTEC 460 及MicroScan等系统。其检测原理是用放射性14C标记血培养肉汤中的葡萄糖和其他微生物生长所需营养物质。当有病原菌生长时，分解葡萄糖或其他营养物质产14CO2。仪器通过检测血培养瓶内14CO2含量并与仪器内设定的生长指数（Growth Index）比较判断血培养阳性或阴性。

第二代血培养仪器是BD 公司于80 年代初推出的BACTEC 660 和BACTEC 730系统，培养基不含放射性物质，检测CO2 采用非放射性红外光谱仪，检测速度加快，操作更加灵活。1990年，BACTEC 860系统投放市场，该系统可通过机械臂自动将培养瓶架放入检测器内检测，培养箱、振荡器与仪器成为一个整体，自动化程度更高，每天的生长指数和不同种类培养瓶的生长指数可以自己设置（BACTEC 660和BACTEC 860）每天自动检测一次或两次。

第三代血培养仪器，Malthus 112L微生物生长分析仪，其检测原理是将培养基视为一种电传导物质，微生物生长时利用培养基营养物质产生的代谢产物可改变培养基的电传导性，通过检测培养基电传导性改变程度判断是否有微生物生长。该仪器在血培养瓶顶部设计了两个电极与培养瓶内肉汤相连，收到血培养瓶后，放入培养箱并将两个电极与仪器检测器相连，每个培养瓶连接一个检测器，使培养和检测成为一个整体。除放入和取出血培养瓶需人工介入外，整个血培养过程均无需人工介入，由计算机自动控制，每30min自动测量一次培养基的电传导率，可以在血液培养过程中实时提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。检测数据经计算机处理，用图形、数值或曲线显示在屏幕上，超过仪器设定的域值显示为阳性结果。

b. 通过生化试验等方法对分离的细菌加以鉴定并进行药物感敏试验

20世纪70年代中期，国外公司研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法——微生物数码鉴定法。数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知细菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。

目前，微生物编码鉴定技术仍然得到普遍应用，如API、Micro- ID、RapID、Enterotube、BBL Crystal、Minitek等系统，这类鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。

c. 自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统

自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统在临床微生物实验室的应用，为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断和药敏试验提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。

药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器，或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

半自动细菌鉴定和药敏分析系统：由计算机和读数器两部分组成，鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果，有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。主要仪器包括生物- 梅里埃公司的VITEK-ATB、Dade MicroScan公司的AutoScan-4、BD公司的BBLTM CrystalTM、Trek Diagnostic Systems 公司的AutoReader等。

全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统
如下所述。

（1）VITEK 系统：生物- 梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产品有以下4 个规格VITEK AMS 32、60、120、240，鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h 对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。

获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液；置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97 种抗生素和测定超广谱β- 内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定，如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。

VITEK-2 和VITEK campact 是生物- 梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20 种抗生素。

（2）MicroScan Walk / Away 系统：除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16~18h，快速板测定只需2~3.5h。该系统有8 种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800 种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90%菌株可在5.5h 内获得对17~33 种抗菌药物的MIC值。此系统有Walk / Away-40 和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。

（3）PHOENIXTM 系统：由BD公司生产的新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统。应用BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色反应双重标准进行药敏试验结果判断，有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰阳性菌139种、革兰阴性菌158 种。有鉴定板、药敏板或鉴定/ 药敏复合板3 种可供选择。每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17 种抗生素5 种浓度或28 种抗生素3 种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3~6h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4~6h内出结果。

（4）SENSITITRE ARIS系统：培养箱中设置可存放64 块板的转盘，每块板均能检测3 个标本，故同时可检测192 个菌种标本。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。在较短时间内能够分析不同生化底物所反映出的荧光物质，通过荧光读数仪检测板孔中荧光Biocide和Willcox 值来鉴定细菌。该系统的药敏试验有两种测定法，即当采用人工判定时为比浊法，当采用仪器自动判读时为荧光测定法。但均参照NCCLS的标准和规则来解释结果。大多数菌种均可在5h内报告检验结果。通常有革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定板和300 多种抗菌药物不同组合的药敏板及鉴定/ 药敏复合板。

2. 应用分子生物技术的微生物鉴定自动化系统

应用分子生物技术的微生物鉴定自动化系统是通过检测微生物核酸或蛋白质鉴定其种或属。随着分子生物学研究的不断深入，不同的检测方法被用于微生物的快速鉴定，如16sRNA测序，以及Rep-PCR技术（The DiversiLab System微生物菌株分型系统）被广泛的用于微生物研究领域，利用质谱仪快速鉴定微生物。近1~2 年分别通过了欧洲CE认证和美国的FDA准入，可用于临床微生物的鉴定。

质谱仪是利用电磁学原理使气体分子转变成带正电荷的离子，并根据离子的质荷比将其分离，同时记录显示这些离子相对强度的一种仪器。首先使样品离子化，在极高的真空度下，采用高能电子束轰击气态分子，使之成分子离子：然后将离解的阳离子加速导入质量分离器中，利用离子在电场或磁场中运动的性质，将离子按质荷比的小顺序进行收集和记录，得到质谱图。通过对质谱图各峰的识别和解析从而达到分析检测的目的。

目前可用于临床的仪器有：BRUKER（德国生产）通过了欧洲CE认证；VITEK MS（法国生物梅里挨生产）通过了欧洲CE认识和美国的FDA准入，有望今年通过SFDA准入并应用于国内市场。



(来源《世界医疗器械》2011年11月)
罗燕萍女士，主任技师，解放军总医院微生物科主任，中国微生物学会分析微生物学专业委员会、解放军医学计量科学委员会医用标准物质专业委员会、医学参考报检验医学频道微生物与临床专业委员会委员，北京市卫生局和医院器械委员会评审专家。

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