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标题:浅析蛋白纯化的标签
medicilon
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1
发表于 2018-5-17 09:49
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浅析蛋白纯化的标签
一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝,为了研究某一个蛋白质,必须先将目的蛋白质从其他细胞组分中分离提纯出来,如果打算将目的蛋白应用于下游实验,那么成功表达重组蛋白是很重要的。倘若在试验开始时花点时间做好蛋白优化,将会大大增加后续试验的可行性。
蛋白纯化
这一过程通常从细胞裂解开始(对于分泌性蛋白质的提纯则不需要裂解细胞),通过破坏细胞膜将细胞内含物释放到溶液中,从而获得含有目的蛋白质的细胞裂解液,然后通过超速离心将细胞裂解液中膜脂和膜蛋白、细胞器、核酸以及含有可溶蛋白质的混合物。目前我国的一些医药研发外包服务公司,例如美迪西生物医药提供的就有蛋白纯化这一服务项目。
常用的蛋白纯化标签
1
、
His
标签
His tag
(组氨酸标签)融合蛋白是目前最常见的表达方式,其优点是标签小,纯化步骤简便,纯化条件温和,能纯化可溶性
/
包涵体蛋白,一般不会影响蛋白的功能结构,且可以产出大量的目标蛋白,但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。
2
、
GST
标签
GST tag
(谷胱甘肽巯基转移酶)是最常用的亲和层析纯化标签之一,带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化。它的优点是洗脱条件温和,有助于保持蛋白功能活性,适合
pull-down
检测,具有很好的线性动态范围,缺点是分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验,如果蛋白不可溶,很难用变性的方法进行纯化。
3
、
MBP
标签
MBP tag
(麦芽糖结合蛋白标签)可以减少目标蛋白的降解,增加蛋白的表达量和稳定性,提高表达产物的水溶性,但标签较大,对蛋白的结构和功能会有一定影响。
4
、
NusA
标签
NusA tag
(转录终止
/
抗终止蛋白标签)不具有独立的纯化标签功能,需要和其他标签(如
His
标签)联用,可提高蛋白质的溶解性,但由于分子量较大,对蛋白下游应用会有影响。
5
、
Strep
标签
Strep tag
(
strep
标签)能产出高纯度(
95%
)的目标蛋白,且能保持目标蛋白活性,主要是因其纯化流程温和。其次,能进行变性条件下的纯化,在用于
WB/ELISA
,可侦测目标蛋白;另外,还可固定目标蛋白,检测蛋白质交互作用,或更进一步用以筛选治疗用蛋白质,或是工业用酵素。但
Strep tag
纯化系统的价格相对
His tag
而言较高,所产出的目标蛋白数相对较少。
6
、
Flag
标签
Flag
标签蛋白为编码
8
个氨基酸的亲水性多肽(
DYKDDDDK
),同时载体中构建的
Kozak
序列使得带有
Flag
的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
Flag
作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。通过
Flag
进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高;
Flag
作为标签蛋白,其可以被抗
Flag
的抗体识别;融合在
N
端的
Flag
,其可以被肠激酶切除(
DDDK
),从而得到特异的目的蛋白。因此现
Flag
标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。
三、蛋白纯化的
3
种新标签
上述的常用的蛋白纯白标签
His
标签、
GST
标签、
MBP
标签等,尽管这些标签系统各具特色,但它们也分别存在着一些缺陷,还无法完全满足研究者们的需求。为此,
Biotechniques
杂志盘点了近期出现的三种新蛋白标签系统,以便为研究者们提供更大的选择空间。这三种蛋白便签系统分别利用了高亲和力单抗、无机矿物基质以及能够剪切标签的金属离子。
1
、单克隆抗体标签
日本研究者
Yukinari Kato
在开发胶质母细胞瘤的治疗性抗体时,无意中发现了一个可用作亲和标签的肽段。
Podoplanin
蛋白是一个在恶性癌细胞中高度表达的跨膜蛋白,
Kato
生成的大鼠单克隆抗体
NZ-1
可以靶向该蛋白中一个
14
个残基的肽段。他们发现
NZ-1
与
Podoplanin
蛋白的亲和力特别高,可以将其开发成为一个蛋白标签系统。研究人员将与
NZ-1
结合的
Podoplanin
肽段称为
PA
标签,并将其与现有的其他标签系统进行比较,发现
NZ-1
和
PA
标签之间的亲和力更高,解离更慢。目前他现在正努力将这一标签系统应用到蛋白质组分析中去,希望能够用其替代
FLAG
标签。
2
、磷灰石基质
人们常常用固化的抗体和金属离子来纯化重组蛋白,不过这些方案并不完美,存在着金属离子析出、稳定性低和成本高等问题。为此,
Jacobs
大学的
Marcelo Fernandez-Lahore
用无机矿物氟磷灰石,开发了一个新的亲和标签纯化系统。以磷酸钙为基础的磷灰石(例如羟磷灰石和氟磷灰石),几十年来,一直被用作生物分子的吸附剂,其优势在于这种物质既没有抗原性也没有细胞毒性。然而,人们一直未能将它们用于层析法蛋白纯化。因为此前的磷灰石基质“颗粒形状不规则,且在某些条件下很容易溶。
3
、二合一系统
尽管许多蛋白与亲和标签融合后也能够正常工作,但不少实验还是要求去除这些标签。人们往往将剪切位点设计在蛋白标签旁边,以便用蛋白酶消化时能够将其切下来。为了进一步简化这一过程,哥本哈根大学的
Niels ErikMøllegaard
提出了一个有趣的新标签系统。在该系统中,一个分子可以同时实现亲和结合和蛋白标签的剪切,这个分子就是二价铀酰离子(
UO22+
)。
[
本帖最后由 medicilon 于 2018-5-17 09:57 编辑
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