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昆虫细胞表达系统用于制备病毒样颗粒的研究

病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLPs），也称为核心样颗粒，它不含病毒基因组，不能自主复制，在形态上与真正的病毒粒子相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体产生免疫保护反应。病毒样颗粒VLPs的制备，通常是在表达系统中进行外源表达，然后进行体外组装，昆虫细胞表达系统是目前VLPs制备中最常用的表达系统。
病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力，这为病毒的基础研究及疫苗的开发提供了便利条件。VLPs可以直接从表达病毒衣壳蛋白的细胞或培养基中分离得到，也可以先将衣壳蛋白亚基纯化后，在体外组装成VLPs。利用昆虫细胞表达系统进行VLPs进行制备时主要是利用bac-to-bac技术将外源蛋白转座进入杆状病毒 bacmid 中，再将该重组病毒转入昆虫细胞中大量表达，最后外源蛋白自发在细胞中装配成VLPs。美迪西科研人员建立了成熟的杆状病毒-昆虫细胞表达服务平台，提供包括重组杆状病毒制备、重组蛋白及其复合物的表达与纯化服务。
VLPs的制备原理是在体外高效表达某种病毒的一种(或几种)结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。其方法主要是将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中，再将这些载体转入原核或真核细胞中进行表达。绝大多数VLPs的构建选择的都是真核细胞表达系统，使用原核表达系统的较少，主要是由于原核表达系统不能对蛋白进行必要的修饰，不利于VLPs的形成。目前已有报道通过多种系统表达病毒结构蛋白成功构建VLPs，如昆虫细胞表达系统、酵母细胞表达系统、植物细胞表达系统、哺乳动物细胞以及原核细胞表达系统。
昆虫细胞表达系统可以行使蛋白的翻译后修饰功能，对目的蛋白进行糖基化，并且可以使得外源蛋白大量积累，同时不含动物病原体。除此以外，由于杆状病毒基因组巨大，可允许多个外源基因同时插入病毒基因组中进行表达，该系统可在细胞培养基中高密度大量表达外源蛋白。杆状病毒的宿主范围窄，不感染人类，病毒灭活方法简单，该表达系统能对病毒结构蛋白进行多种修饰，利于正确包装VLPs。
在昆虫细胞内表达的病毒结构蛋白可以自组装成VLPS并分泌到培养基中，可以采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化VLPs，纯化后的VLPs不含哺乳动物组分，安全性好，因此该系统广泛用于构建VLPs。
肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)属小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Entero virus)，是手足口病(Hand-foot-and-mouth Disease, HFMD)的主要病原之一，其感染低龄儿童出现的严重神经系统及心肺功能衰竭等综合症可引起较高的死亡率。使用EV71VLPs联合弗氏佐剂经皮下注射免疫小鼠可刺激产生一定的中和抗体水平，并对新生小鼠起到一定的保护作用，这为此类疫苗的开发提供了一定的依据。
以C4亚型毒株作为EV71疫苗的候选株，通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备了EV71VLPs，利用小鼠模型以更低的免疫剂量联合人用A1(OH)3佐剂进行了动物实验来评价该VLPs疫苗刺激产生的体液免疫和细胞免疫效果。并且，除了对该疫苗的有效性进行了评估之外，研究还通过组织器官包埋切片、HE染色和免疫组化等方法对小鼠各组织器官进行了病理学和病原学的分析，更为深入的解释了评估该候选疫苗的免疫原性和免疫保护性的意义和价值。结果表明，该EV71VLPs疫苗可在小鼠病毒感染过程中有效的阻止病毒在动物体内的增殖，对小鼠可起到完全的保护效果，是一种很有开发前景的疫苗。
目前人医对VLP疫苗的研究发展较快，通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备了一系列病毒样颗粒疫苗，在人类乳头瘤病毒样颗粒(HPV VLP)、人类免疫缺陷病毒样颗粒(HIVVLP)、流感病毒样颗粒和肝炎病毒样颗粒等方面取得了一系列重大进展。
但昆虫细胞表达系统并非完美。首先，昆虫细胞糖基化修饰与哺乳动物细胞不同，后者合成的糖蛋白含有唾液酸末端的杂合型N－糖链；而昆虫细胞表达的蛋白糖链仅包含数个甘露糖或海藻糖等的寡糖类。另外，由于目的蛋白与杆状病毒颗粒共表达，容易产生污染，因此，VLPs的纯化是使用昆虫-杆状病毒表达系统时尤为值得注意的问题。
除了可以生产无囊膜VLPs，昆虫-杆状病毒表达系统还可用于生产具有囊膜结构的VLPs。目前，除了已上市的HPV双价VLPs疫苗以外，其它如细小病毒、流感病毒( H1N1、H1N5) 、诺瓦克病毒、呼吸道合胞体病毒等VLPs 疫苗，已经进入临床Ⅰ、Ⅱ期试验。另外，多种兽用VLPs疫苗也已经利用该系统进行生产，如蓝舌病病毒、鸡贫血病毒、鹅出血性多瘤病毒等。