小中大western-blot实验中ECL发光检测实验步骤
ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例，说一下检测实验步骤。
1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。
注意：Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为:
储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 储存液浓度为1mg/ml 的二抗推荐稀释度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml 1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2. 新鲜配制发光工作液。将BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成发光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 发光工作液)。转移到清洁的塑料小盒中。
3. 用镊子将漂洗过的膜取出，将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，轻轻摇晃，室温孵育几十秒到1 分钟。
4. 用镊子将膜夹起5-10 秒，并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液，迅速将膜完全包裹于洁净保鲜膜内，去除气泡和褶皱，蛋白面朝上固定于X 片暗盒内。
5. 在黑暗中一次重叠放入3 张X 光胶片，30 分钟或更长时间后全部取出显影。
6. 对同一张膜进行多次蛋白杂交：用PBST 或TBST 洗涤掉发光液（10min×3 次），然后从开始一抗杂交即可。
Western-blot中ECL发光液的选择很重要，Enlight-Plus检测级别可达pg级，发光时间长，背景低，得到的图像很漂亮，非常有利于实验的进行。
