一种经典的蛋白分离方法之盐析沉淀法

盐析沉淀法是一种经典的蛋白分离方法,包含在一些公司提供的蛋白分离服务中,该法主要适用于蛋白质(酶)等生物大分子物质。在高浓度中性盐存在下,它们在水溶液中的溶解度降低而产生沉淀,成为盐析法。

在蛋白分离和蛋白纯化过程中,为了得到目的蛋白,首先要从原材料中提取目的蛋白,然后通过粗分离的方法除去大量杂质,最后进行精细分离。蛋白质的分离纯化在生物化学研究中应用广泛,是一项最要的操作技术。美迪西提供蛋白分离服务,其拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)、哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

1、盐析沉淀法的基本原理

一些公司提供的蛋白分离服务目的旨在从复杂的混合物中分离出单种类型的蛋白。蛋白质为两性物质,一定pH下表面显示一定的电性,由于经典斥力作用,使分子间互相排斥;同时由于蛋白质分子周围,水分子成有序排列,在其表面上形成了水化膜,水化膜层能保护蛋白质粒子,避免其因碰撞而聚沉。因此蛋白质等生物大分子物质是以一种亲水胶层形式存在于水溶液中,无外界影响时,呈分散状态。

当向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐时,会产生2种现象:低盐情况下,随着中性盐粒子强度的增高,蛋白质溶解度增大,称盐溶现象。但是在高盐浓度时,蛋白质溶解度随之减小,发生了盐析作用。产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合,形成离子对,因此盐离子部分中和了蛋白质的电性,使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢、聚集起来。盐析作用的另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大,盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜,暴露出疏水区域,由于疏水区域的相互作用,使其沉淀。

2、盐析沉淀法分离纯化血浆中的IgG和白蛋白的研究

当前,一些公司提供的蛋白分离服务主要采用有机溶剂沉淀、多步离心等初分离的方法以及柱层析的方法进行分离纯化。

IgG是血液中含量最多的抗体,它是抗感染的主力军,能够促进巨噬细胞的吞噬作用,同时还具有活化补体的功能。白蛋白占血浆胶体渗透压的80%,主要调节组织与血管之间水分的动态平衡。由于白蛋白分子量较高,与盐类及水分相比,透过膜内速度较慢,使白蛋白的胶体渗透压与毛细管的静力压抗衡,以此维持正常与恒定的血容量。白蛋白还具有运输营养物质和将有毒物质输送到解毒器官及营养供给作用。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素,同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成,外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。

有研究者利用盐析沉淀法萃取分离纯化血浆蛋白和重组人胰岛素[1]。该研究者首先在前人的结果基础上,验证了500g体系中17.5%乙醇/20% K2HPO4体系和14%乙醇/20% K2HPO4盐析萃取分离效果,发现14%乙醇和20% K2HPO4体系放大稳定,在pH7.0下,白蛋白和IgG分布在上相且得率分别为90%65%17.5%乙醇/20% K2HPO4体系则易使IgG沉淀。对14%乙醇/20% K2HPO4体系的萃取相,进行了疏水层析和离子交换层析条件的优化,在优化的条件下,可以得到电泳纯的IgG,但白蛋白的纯度较低。

其次考察了血浆蛋白在叔丁醇/盐体系中的分配情况。结果表明,在15%叔丁醇/14% K2HPO4pH7.0和添加7.5% NaCl的条件下,血浆中的白蛋白主要分布在下相,收率为98%,而IgG以沉淀的方式分布在上下相界面中间,收率为77%,有利于两种蛋白的分离。将叔丁醇/K2HPO4体系的的萃取相和沉淀相,使用优化的疏水层析和离子交换层析进行纯化,可以得到电泳纯度为100%IgG和纯度为87%的白蛋白,该方法操作简便、收率高,具有较好的应用前景。

最后研究了重组人胰岛素在盐析萃取体系中的分配情况,并通过对盐析萃取体系的初筛及条件的优化,筛选出了最优的盐析萃取体系。在18%乙醇/22% K2HPO4pH 9.0条件下,重组人胰岛素分布在上相,回收率在98%以上。