蛋白质含量测定方法之Lowry法

在蛋白质分离和纯化之后,需要测定溶液中的蛋白质总量或者某一蛋白质的含量。Lowry法是一种常见的测定蛋白质含量的方法,往往包含在蛋白分离公司提供的服务中。Lowry法又称为Folin酚试剂法,通常测定范围是20250μg,最低可检测5μg的蛋白含量,检测灵敏度范围在5100μg/ml

Lowry法最早是由Lowry确定蛋白质浓度测定的基本步骤,以往在生物化学领域中广泛应用。Lowry法的显色原理是根据双缩脲反应,蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反应,生成紫红色Cu+复合物。Folin酚试剂在Cu+的催化下,磷钼酸-磷钨酸盐被蛋白质中的芳香族氨基酸残基还原,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物,其最大吸收峰在745750nm处。在一定的浓度范围内,所形成蓝色的深浅与蛋白质含量之间有线性关系,可用于蛋白质含量的测定。

在蛋白质混合物经过粗分离、纯化后,可以得到目的蛋白。蛋白分离公司提供的蛋白的粗分离服务首先是使用蛋白质提取缓冲液提实验材料,由于蛋白提取中目标蛋白质的浓度往往较低,需要采取一些简单的方法使目标蛋白浓缩,同时去除大量的杂质。然后根据蛋白质分子大小、分子性状、分子表面特征或分子带电状况进行进一步纯化,也就是蛋白质的细分级。在蛋白分离纯化后,使用Lowry法测重组蛋白的含量。美迪西提供蛋白分离服务,可以根据客户要求,承接从mgkg级的化合物纯化分离服务。

1、Lowry法测重组艾塞那肽蛋白含量

有研究者对Lowry法测量重组艾塞那肽蛋白含量的不确定度进行分析和评价。通过建立Lowry法测量重组艾塞那肽蛋白含量的的数学模型,找出影响不确定度的因素,并对各个不确定度分量进行评估。结果计算出了各变量的不确定度,取包含因子K=2,置信概率为95%。发现此评价方法适用于Lowry法测量重组艾塞那肽蛋白含量的不确定度评估。

2、Lowry法测重组人血清白蛋白-IL2融合蛋白含量

该研究试验验证了Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法,为后续试验提供重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的检测方法。发现Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法稳定、可重现。重组人血清白蛋白-白细胞介素2200~10μg/mL质量浓度范围内均一。

3、使用Lowry法的注意事项:

(1)为了保证反应进行完全,反应在25~30℃水浴中进行,反应30min后准时比色。

(2)由于产生的混合物的蓝色强度部分取决于酪氨酸和色氨酸含量,而它们在各种蛋白质中含量不同,因此会随不同的蛋白质而出现显色深浅的变化。通常用于酪氨酸和色氨酸的定量测定和蛋白质的相对浓度测定。

(3)由于Folin试剂的主要成分为磷钼酸和磷钨酸,试剂仅在酸性pH条件下稳定,而还原反应又只在pH1010.5范围内发生,因此在进行测定时,Folin酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中,必须立即混匀。

(4Folin试剂的配制较为困难,近年来逐渐被考马斯亮蓝法取代。然而考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低,且不同蛋白质与色素结合状况有差异。

(5)在Lowry法中,由于加入Folin酚试剂强化了双缩脲反应,使得显色量增加,检测灵敏度提高且比较恒定。