蛋白质样品制备要求尽可能的获得所有蛋白质，是Western印迹分析方法的第一步。在蛋白质样品制备过程中，样品处理得合适与否，获得的蛋白含量高低以及质量优劣直接影响Western印迹分析结果的可靠性。蛋白质样品制备包括：选择材料和预处理、细胞的破碎及细胞的分离、提取和纯化及浓缩、干燥和保存这几步。
1、样品制备的基本原理
（1）用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；
（2）将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使备组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。
蛋白质样品制备中，使用裂解液提取蛋白至关重要。尤其是对于低含量小分子蛋白的Western印迹分析中，通过多种方法提高蛋白样品的浓度和分辨率是改善实验条件的常用策略。对于蛋白质样品制备存在多种不同组成、不同浓度的裂解液，每种裂解液适用的对象和裂解效果不同，没有一种普遍适用于各种样品的裂解液配方，因此需要根据实验材料和检测目的选择合适的蛋白质裂解液是做好Western印迹分析的首要前提。
Western印迹分析是蛋白分析的一种常规技术，也是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。上海美迪西提供新药研发外包服务，其生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。
不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠(SDS)和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂的裂解缓冲液。使用裂解缓冲液之后，一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在4℃下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。
在制备细胞培养物裂解物和制备组织裂解物之后进行蛋白质的浓度测定。确定蛋白质的浓度可进行Bradford分析、Lowry分析或二喹啉甲酸(BCA)分析，通常使用牛血清蛋白(BSA)作为蛋白质标准品。确定每个样品的浓度之后，可将其冻存于-20℃或-80℃以备后续使用，或以备进行免疫沉淀分析或以备凝胶上样。
考马斯亮蓝蛋白定量法是一种蛋白质浓度测定方法，该方法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
2、蛋白质样品制备的影响因素
（1）温度
多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
（2）pH
蛋白质、酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
（3）离子强度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。
3、蛋白质样品制备需要注意的问题：
（1）在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；
（2）选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液；
（3）尽量去除核酸、多糖和脂类等干扰分子；
（4）防止蛋白质在样品处理过程中的人为修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰，一般建议加入合适的蛋白酶抑制剂；
（5）样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。
由于生物体中的蛋白质具有多样性和复杂性，因此目前没有一种方法能够将整个蛋白质组一次性完全提取出来。在Western印迹分析中不同的蛋白质样品制备方法，其所使用的试剂的物化性质差别也很大，因此对细胞、组织等样品的裂解能力以及对不同种类蛋白的溶解能力也会有很大差异。
