杆状病毒表达体系在表达重组药用蛋白上的应用

杆状病毒是一类专门寄生于节肢动物的病原微生物,杆状病毒载体表达系统自问世以来,由于其不具备任何对哺乳动物有潜在的致病性的动物病毒片段,且具有表达的产物成本低、表达量高、构象接近天然蛋白等特点。因此可以将其用于免疫活性分子,及抗原、抗体、生长因子、酶和干扰素等重组药用蛋白的大量生产。

杆状病毒载体表达系统目前已被广泛应用于外源目的基因的表达,由于利用真核的昆虫幼虫或昆虫细胞作为宿主,其表达的蛋白质能够进行正确的转录后加工。杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上。此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组获得重组病毒,将重组病毒纯化感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。

杆状病毒基因组本身较大且可操作性好,可以容纳多个基因或较大的基因,而且杆状病毒在自然条件下不能感染脊椎动物,生物安全性好,这些优点使得杆状病毒载体表达系统成为一项比较成熟、安全、经济和高效的蛋白质表达技术。美迪西科研人员建立了成熟的杆状病毒-昆虫细胞表达服务平台,提供包括重组杆状病毒制备、重组蛋白及其复合物的表达与纯化服务。

1、乙型肝炎病毒突变型表面抗原在杆状病毒载体表达系统中研究

乙型肝炎病毒S基因编码的HBsAg是当前乙肝疫苗的主要成分,也是HBV感染诊断的重要依据。抗-HBs抗体可用来预防肝移植后HBV的再感染和母婴垂直感染,但这有赖于HBsAg与抗-HBs抗体之间的相互作用。当HBsAg抗原性发生改变可直接影响HBV感染后的诊断和治疗。目前所知,S基因突变发生率最高的部位是表面抗原中第145位氨基酸(基因m587GA)的甘氨酸→精氨酸的突变(G145R)。这种新的变异株可导致疫苗免疫失败、肝脏移植后HBV再感染和母婴垂直传播等,给乙肝防治带来了新的问题。

有研究者从一份献血员血清中分离到一株G145R突变的HBV病毒X119,设计S区引物从中扩增出S基因,利用杆状病毒表达系统进行变异型表面抗原(119s)的大规模表达。通过液相色谱和CsCl平衡梯度离心等手段对目的蛋白进行纯化,获得纯化的119s经透射电镜观察证明其可自发组装成病毒样颗粒。为考察表达的重组抗原的免疫原性,该研究用纯化后的119s抗原免疫小鼠,结果经119s免疫的小鼠产生了针对119s强烈的特异性免疫应答,而阴性对照组则无特异抗体产生,证明颗粒性的119s蛋白具有良好的免疫原性。可见重组杆状病毒表达系统表达生产的突变型sAg有望作为新乙肝疫苗的组成成分,以提供对G145R突变株的保护。

2、利用杆状病毒载体表达神经营养素-3的研究

神经营养素-3NT-3)是神经营养家族的第3个成员,具有广泛的神经营养活性,不仅能在体内维持受损伤神经元的存活及其神经纤维的再生,而且也能够影响体外培养的神经元分化。利用基因工程手段获得大量的活动性的NT-3将促进对NT-3的基础医学和临床应用的深入研究。有研究者在实验中选择了杆状病毒表达体系表达人NT-3(hNT-3)。这一真核表达系统与真核细胞比较接近的蛋白质翻译后加工修饰机制,并具有容纳大生段外源基因、不依赖辅助病毒、高水平表达重组蛋白、操作简便、和易于纯化安全等优点。

研究者构建了转移载体pBacPAK9-hNT-3在培养上清中NT-3粗品产量约为100mg/L.这一较高的表达产量能够进一步的蛋白纯化。

在医药方面,使用杆状病毒载体表达系统可以用于基因工程疫苗和生长因子、酶和干扰素之类的药用蛋白质的大量生产研究。在动物和人类重大疾病的药物研究方面,利用杆状病毒载体系统可以研制具有高灵敏度的重组抗原,从而应用于重大疾病的医疗诊断,同时开发一些检疫工作中急需的诊断用抗原,因此杆状病毒载体表达系统的应用和市场前景广阔。