蛋白激酶活性检测方法之表面等离子体共振法

作为目前最重要的潜在药物靶点之一,且以蛋白激酶为靶点的一系列药物成功开发,各个酶活性检测服务公司竞相开发相关的激酶检测方法和试剂盒,用于筛选和优化新的化合物作为新药候选者。表面等离子体共振(SPR)法作为一项生物分析技术,是一种研究分子间相互作用力的理想技术,目前常用于生物大分子相互作用分析系统Biacore中。有研究者基于SPR技术开发了快速、简便检测蛋白激酶活性的方法。

在细胞信号传导、细胞周期调控等系统中,各种蛋白激酶形成了纵横交错的网络,在细胞的生命活动中起到了广泛的作用。蛋白激酶介导了真核生物细胞大量的信号转导,通过磷酸化修饰影响底物蛋白质的活性。同样它也控制者许多细胞内的生理活动,包括新陈代谢、细胞骨架重分布、细胞运动等。蛋白质磷酸化是一个相当重要的生物学过程,参与了生长发育、平衡调节、神经免疫系统的内部联络等各项生理功能。

目前已知一些蛋白激酶的点突变、序列缺失导致该激酶的活性或者表达水平异常时,所占比例以癌症居首,同时也包括诸如炎症、糖尿病、肥胖、自身免疫疾病、神经退行性疾病、心血管系统疾病以及代谢性疾病等。蛋白激酶在许多恶性肿瘤中都有过高的活性,现在已经是最重要的潜在药物靶点之一,蛋白激酶酶活性检测服务可以帮助药物筛选研究。美迪西提供酶活性检测服务,如脂肪酶、木聚糖酶、歧化酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、尿素酶、糖化酶、植酸酶、淀粉酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、α—淀粉酶制剂、精制果胶酶、糖化酶、脂肪酶、角蛋白酶等酶制剂的检测服务。

表面等离子体子共振是一种物理光学现象。当一束平面光波从介质1进入到介质2时,入射光在介质1接触界面上一部分发生反射,另一部分则透射进介质。SPR技术是基于SPR原理的生物传感分析检测技术,实时传感图谱的变化缘于靠近传感芯片表面介质折射率的变化。对于多数分子来说,相同质量的分子在界面引起的SPR角的改变都是相当的,因此SPR监测的结果实际上是芯片表面物质质量的变化。

无需借助标记物进行分析使SPR技术广泛应用于各类生物体系的测定,分析样品类型从小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖到类脂、脂质体,甚至噬菌体、病毒和细胞,研究分子之间有无结合以及相互作用的亲和力强弱、结合/解离的快慢,分析结合位点和结合顺序,并且寻找受体、配体、底物、疾病靶点等。

研究者开发了一种快速、简便测定蛋白激酶活性的方法,在金膜表面固定一端带有半胱氨酸的多肽底物,蛋白磷酸化后,加入锌()化合物(生物素化的Zn2L3+),最后加入链酶亲和素(SA)进一步放大信号。还可以利用SPR成像技术同时检测多个芯片上的反应,来分析固定在芯片上的多肽探针,此法常用来评估芯片表面蛋白磷酸化的程度对测定蛋白激酶活性及抑制剂筛选非常有效。

还有研究者发明了一种涉及使用表面等离子体共振(以下称为SPR)的分析技术实现对蛋白激酶活性的简单分析的快速有效的方法。更具体地说,该方法是蛋白激酶活性的新型分析技术以及基于物质相互作用的SPR分析产生图像的表面等离子体共振成像(SPR成像)的应用。研究者发现了一种方法,如果和SPR方法一起使用,则不需要使用标签,例如荧光或放射性物质。螯合化合物的使用降低成本并且易于处理。此外,由于该用途,该方法不受磷酸化氨基酸类型或邻近氨基酸序列的影响。而且该项发明能够综合分析许多类型的蛋白激酶信号,这导致药物给药后或引入其功能未知基因的细胞间蛋白激酶动力学的有效分布。因此,该发明预计将在基因组药物开发中得到应用,例如分析新基因的功能和作为药物研究工具。

随着传感器技术的发展,SPR技术具有实时、快速、无须标记、灵敏度高、重复性好的等优点而受到了人们的青睐,现在主要应用于以下分析领域:分子相互作用模式的研究;动力学常数的测定;亲和常数测定及浓度的测量等,SPR技术应用于生命科学研究的领域有:蛋白质组学研究、癌症研究、新药研发、信号传递、分子识别、免疫调节、免疫测定法、疫苗开发、瞬时结合、配体垂钓、结合特异性、结构与功能的关系及酶反应等。随着SPR仪器和传感芯片技术的不断发展和完善,结合各个领域研究的拓展,SPR技术的应用将更加趋向多样化,具有广阔的发展前景。