碱性成纤维细胞生长因子的表达与干细胞增殖作用研究

碱性成纤维细胞生长因子bFGF在很多体内实验研究中证实它具有促进细胞增殖、促成纤维和神经生成的作用。由于bFGF和其他细胞因子一样,在动物组织中含量甚微。为了满足临床和科研的需要,有研究者采用杆状病毒载体表达系统表达人碱性成纤维细胞生长因子,并获得了具有生物学活性的bFGF蛋白。还有研究者探讨了碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖的影响作用。

1940年,Hoftman等在脑和垂体的提取物中发现的一种能够促进成纤维细胞生长的物质。Gospodarowicz等于1974年首先成功分离该物质,并命名为成纤维细胞生长因子FGF。根据等电点的不同,FGF分为酸性aFGF和碱性bFGF两种。bFGF来源于神经组织、垂体、肾上腺皮质、视网膜、黄体和胎盘等,具有广泛的生物学活性。它能够刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增殖,在体内它对内皮细胞有趋化和促进有丝分裂的作用,可促进血管的生成。FGF还能介导神经元的分化、存货和再生,刺激神经胶质细胞移行,参与细胞过度增殖和血管过度形成所引起的多种病理损害。为了利用基因工程技术来生产大量的bFGF蛋白用于研究,有研究者利用了Bac-to-Bac杆状病毒载体表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性

1、杆状病毒载体表达系统表达人bFGF的研究

杆状病毒载体表达系统目前已被广泛用于外源目的基因的表达,由于其不具有任何对哺乳动物有潜在的致病性的动物病毒片段,且表达的产物成本低、表达量高,构象接近天然蛋白等特点,因此可以用于免疫活性分子和重组药用蛋白如抗原、抗体、生长因子、酶和干扰素等的表达和生产研究。美迪西提供蛋白表达服务,其科研人员建立了成熟的杆状病毒-昆虫细胞表达服务平台,提供包括重组杆状病毒制备、重组蛋白及其复合物的表达与纯化服务。

研究者将人bFGFcDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Westernbloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。研究结果发现利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。

2、碱性成纤维细胞生长因子对神经干细胞增殖的影响

有研究者探讨了碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖的影响及其与荧光金标记神经元数量增加的相关性。研究者将昆明小鼠48只随机分为正常组、脊髓损伤组、治疗组、假手术组。脊髓损伤组、治疗组建立急性脊髓损伤模型,正常组仅实施手术而不损伤脊髓,在脊髓损伤后恢复意识2h起开始,治疗组每日腹腔内注射溶有碱性成纤维细胞生长因子(25μg/kg)的含1%白蛋白的MTPBS。在第7天对前3组小鼠再次实施手术,于L1节段置入浸润荧光金的无菌明胶海绵,假手术组不进行处理。

运用RotarodPlatformHang实验对小鼠的运动能力进行测试,使用荧光金对小鼠皮质脊髓束和红核脊髓束中的神经元进行标记计数,通过免疫组化检测nestin阳性内源性神经干细胞的数量,同时分析荧光金标记的神经元数量与内源性神经干细胞数量间的相关性。结果发现:

(1)碱性成纤维细胞生长因子可显著改善受伤小鼠的运动功能,经碱性成纤维细胞生长因子处理后内源性神经干细胞数量明显升高,且与荧光金标记的神经元数量的增加存在相关性;

(2)结果表明,碱性成纤维细胞生长因子在脊髓损伤后内源性神经干细胞的增殖过程中起着重要作用,而内源性神经干细胞通过增加再生神经元的数量使运动功能得到恢复。

研究碱性成纤维细胞生长因子的作用机制,并运用基因表达系统进行其表达与大量生产研究,为更好地发挥其作用来满足临床需要提供了研究基础。杆状病毒载体表达系统具有基因容量大、操作性好、表达效率高、生物安全性好和靶向性强等优点,随着生物科学技术的不断进步,杆状病毒载体表达系统在表达细胞因子方面的研究将会越来越深入和完善。