细胞转染技术之基因枪转染法

转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术,基因枪转染法包含在细胞转染技术服务中,是一项将DNARNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNARNA在胞内逐步释放、表达的技术。基因枪转染技术可以用于人的表皮细胞、纤维原细胞、淋巴细胞系以及原代细胞的转染,具有简单、快速、可重复、基因传递谱广、不受基因大小及数量限制以及不受靶细胞限制等优点。

例如在肿瘤细胞转染中,在瘤苗的制备中通常采用病毒性基因转移方法,但由于病毒载体的安全性问题,限制了它在该领域的应用。基因枪技术作为一种纯物理的基因转移方法,能高效、安全表达外源基因并且无需患者肿瘤切除标本长期在体外培养,因而在该领域中表现出很大的优势。细胞转染技术服务是将外源分子如DNARNA等导入到真核细胞的技术服务,在转染过程中从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节等综合考虑,有望获得较好的转染结果。美迪西提供细胞转染技术服务,其生物部在分子生物学、细胞生物学、体外生物学和结构生物学领域有丰富广泛的经验。从最初的cDNA文库构建到药物设计,通过蛋白质纯化,结构测定和分析测定,提供一套完整的生物学服务。

1、基因枪转染法转染MCF-7细胞上的研究

研究者建立基因枪子弹制备及将不同质粒DNA转染体外培养人乳腺癌细胞MCF-7细胞系的方法[1]。方法是以亚精氨-氯化钙沉淀法制备子弹,采用基因枪方法分别将真核表达质粒pEG-FPPmcherry转染对照组和实验组MCF-7细胞,转染24h后,利用荧光显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达情况。结果制备了基因枪子弹,基因枪介导的pEGFPPmcherry能够分别和共同转染入体外培养的MCF-7细胞中,转染后24h可检测到红、绿色荧光,而对照组则没有荧光蛋白的表达。因此基因枪能够有效介导外源基因转移并能够实现两种基因的共同转移,基因枪转染的MCF-7细胞能够有效表达报告基因。

2、基因枪转染法转染基因疫苗质粒在人树突细胞中成功表达的研究

研究者利用Ficoll密度梯度法分离人外周血单个核细胞(PBMC),贴壁方法获取单核细胞作为DC前体,在重组GM-CSFIL-4的支持下诱导培养为用于转染的未成熟DC(i mDC);制备人免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因疫苗质粒和增强绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)。通过设定不同的转染条件,采用基因枪方法将pEGFP质粒转染入DC,荧光显微镜下分别计数绿色荧光阳性细胞数和细胞总数,计算转染率;台盼蓝染色计数活细胞,计算细胞存活率;比较基因枪、脂质体及电转染3种方法的转染效率。以基因枪方法在最佳条件下将IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0pEGFP质粒共转染DC,提取细胞RNART-PCR方法检测IgHV1-GM-CSF的表达,ELISA方法检测GM-CSF的表达。

结果选择基因枪转染的优化条件为:转染压力120psi、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度0.02mg/ml、微载体负载量(MLQ)0.5mg/子弹、DNA负载率(DLR)1.5μg质粒DNA/子弹。基因枪转染的效率为10.5%±2.4%(n=3),电转染方法为45.2%±5.6%(n=3),而脂质体方法只有个别DC表达荧光蛋白,三者比较差异有统计学意义(P<0.01)。基因枪方法转染的DC能够保持其特殊细胞形态,细胞表面标志在转染中无明显变化,而电转染后细胞大量死亡。应用基因枪转染方法,基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0DC中得到瞬时表达。因此基因枪颗粒轰击可使基因疫苗在DC中成功表达,是临床细胞免疫治疗中DC转染的一种可行选择。

基因枪转染法作为一种纯物理的基因转移方法,已经成功地介导多种目的基因的体内外转移,在肿瘤基因治疗中发挥着重要的作用。但是同时基因枪对靶细胞或靶组织进行轰击后,残留金属颗粒对机体的长期安全性还有待进一步的研究。