抗肿瘤药物体外药效评价方法之生长曲线法

在进行抗肿瘤药物研发的过程中,一般会先采用实验室的细胞进行细胞药效学研究,研究药物对癌细胞的作用之后,再进行该种药物的动物和人体试验。生长曲线法、MTT法、细胞集落形成法等都是较为常见的体外测定药物对癌细胞的生长抑制作用的方法。有研究者采用体外细胞药效学研究的方法,如生长曲线法,探讨了从中药中提取的化合物在体外对肿瘤细胞的作用研究。

1、生长曲线法的基本原理

在最适的条件下,癌细胞在培养液中呈指数生长,即取细胞数的对数与培养时间作图可得到一条直线,称之为对数生长期。随着细胞密度不断增高,由于代谢产物的积聚及营养物的消耗,细胞生长逐渐减慢以至停止,此时成高坪期或稳定期,药物对细胞生长的影响可以通过生长曲线反映出来。利用细胞药效学研究实验可以从细胞学角度直接观察药物对细胞的作用,上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,可通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAiMicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。

文献上记录的生长曲线法的操作步骤是:以悬浮生长细胞为例,首先取对数生长期细胞用生长培养基配成1*10^4/mL悬液,在25mL培养瓶中接种5mL。然后加入待试药物50μl,置含5%二氧化碳的37℃温箱,在培养后即刻及1天、2天、3天、4天、5天、7天各取样40μl,加0.4%台盼蓝10μl,置血细胞计数板计数,以每毫升拒染的活细胞数的对数与时间作图。台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂,正常细胞能够排斥台盼蓝,而死亡的细胞由于细胞膜的完整性丧失,通透性增加,细胞可被台盼蓝染成染色。

最后进行结果评定,需要注意的是采用悬浮生长的细胞做试验时同一培养物可以连续取样,但是贴壁生长的细胞每一培养物只能做一次计数,因此应先计算好所需的培养瓶数量。

2、蒲葵根提取物的体外细胞药效学研究

从天然植物中寻找新的抗癌药物是新药研究的主要发展方向之一,通过细胞药效学研究,可以研究蒲葵根提取物在体外对癌细胞株的抗癌活性。有研究者采用体外细胞培养法研究蒲葵根提取物对七种肿瘤细胞株生长的抑制作用[1],方法是采用MTT法、细胞集落形成法、生长曲线法测定蒲葵根提取物对白血病细胞株L1210P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经性肿瘤细胞株NG108-15、人肝癌细胞株Hele7404生长的抑制情况。

结果发现MTT法、细胞集落形成法、生长曲线法测定的结果均显示,当蒲葵根提取物浓度在5.0μg/ml以上时,7类肿瘤细胞株的生长均受到明显抑制。因此蒲葵根提取物在体外具有抗肿瘤作用。

3、汉黄芩素体外对人肺癌A549细胞株增殖活性的研究

汉黄芩素是传统中草药黄芩等药材中的天然有效成分,是一种具有抗癌作用的黄酮类化合物。有研究者通过体外实验研究了汉黄芩素对人肺癌A549细胞株增殖活性的影响,为其机制的研究及临床应用提供理论依据[2]。方法是实验通过MTT法、生长曲线法、检测不同浓度汉黄芩素、不同作用时间对肺癌细胞增殖活性的影响,通过HE染色实验观察汉黄芩素对A549细胞形态学变化。

结果实验显示汉黄芩素对人肺癌细胞株有较强的抑制作用,当药物浓度达到10μg/mL时,增殖抑制作用明显。随着给药时间延长,细胞存活浓度递减。汉黄芩素能够改变肺癌细胞形态,用药后与对照组比较细胞变圆,体积缩小,核质深染,胞质凝集。因此汉黄芩素能够抑制人肺癌细胞A549增殖,改变细胞的形态,将对肺癌治疗具有一定的指导意义。

进行细胞药效学研究,以肿瘤细胞株为筛选模型,研究药物在体外对肿瘤细胞增殖作用的影响,为该药物的接下来的动物试验及人体试验研究提供了研究基础,对于药物研发至关重要。

[1]蒲葵根提取物的体外抗肿瘤实验研究[J].

[2]汉黄芩素对人肺癌A549细胞株增殖活性的影响[J].