SOD的酶活性检测方法

超氧化物歧化酶(SOD)是一种新型的药用酶,主要包括Cu/Zn-SODFe-SODMn-SOD,最近又有研究者发现了Ni-SODFe/Zn-SOD。由于SOD催化的反应的特异性,研究者们一直在寻找一种简便、精确且适合其特性的酶活性检测方法。SOD酶活性检测服务也成为医药研发公司的一项常规技术服务内容。SOD的酶活性检测方法有直接法和间接法,由于直接法所需的仪器设备价格昂贵以及SOD基质和-O2-的不稳定性,一般多采用间接法。

SOD广泛存在于多种生物体内,已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内分离得到了SODSOD酶活性检测服务的方法不同,检测方法的反应原理和酶活力单位定义也不同,其灵敏度和差异性也较大。常见的SOD酶活性检测方法主要有以下几种。

1、SOD的酶活性检测方法

(1)细胞色素C还原法

在有氧的条件下,黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸,与此同时产生O2-O2-氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C,后者在550nm处有最大吸收。存在SOD时,O2-被催化而歧化,细胞色素C还原反应速率则降低。根据细胞色素C在加入SOD前后被O-还原的速率变化测定SOD活性。虽然为经典方法,但是灵敏度低、干扰因素多,测试温度要求严格,需要有恒温装置,所用试剂较为昂贵,配制不容易掌握,所以不适用于基层单位采用。在中国cro公司排名中靠前的美迪西专业提供各种酶制剂的检测服务:脂肪酶、木聚糖酶、歧化酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、尿素酶、糖化酶、植酸酶、淀粉酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、α—淀粉酶制剂、精制果胶酶、糖化酶、脂肪酶、角蛋白酶等。

(2)邻苯三酚自氧化法

在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。邻苯三酚法灵敏度高、稳定、重复性好,且试剂配制简单,操作方便、测定快速,如无紫外分光光度计可在420nm测定。溶液PH对其氧化速率影响较为显著,因此在用此法时测定SOD时应严格控制反应体系中的PH值。

(3)羟胺发色法

邻苯三酚发生自氧化产生O2-与羟胺反应生产亚硝酸盐,在酸性条件下,亚硝酸盐与氨基苯磺酸和N-甲萘基二氨基乙烯反应生产红色化合物,而SOD抑制此反应,根据抑制率高低计算活性。

(4)肾上腺素法

肾上腺素法也较简单,所用试剂简单,但是稳定性较差,干扰因素较多,受温度影响较显著,不易控制,而且灵敏度不如邻苯三酚法。

(5)黄嘌呤氧化酶一细胞色素C

在有氧的条件下,黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸,与此同时产生O2-O2-氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C,后者在550nm处有最大吸收。存在SOD时,O2-被催化而歧化,细胞色素C还原反应速率则降低。根据细胞色素C在加入SOD前后被O-还原的速率变化测定SOD活性。

(6)化学发光法

黄嘌呤氧化酶在有氧的条件下,催化黄嘌呤或次黄嘌呤生成尿酸和O2-,进一步与化学发光剂鲁米诺或海莹莹光诱导剂反应,使发光剂受到激发成为激发态,当它返基态时就向外发光即化学发光,根据抑制程度可测得SOD的活性。

SOD的测定方法还有许多,如化学发光免疫测定、氮蓝四唑改良法、极谱氧电极法和碱性二甲基亚砜法等。