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标题:[讨论帖]“黑胶虫”问题

qqq111[使用道具]
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真是麻烦事啊,问题很严重啊,细胞状态一直不好
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fqswdzd[使用道具]
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发个必定被砖的贴。
我觉得对于黑胶虫的定义非常需要规范化。我对这种东西持保留态度,一是我自己还没有遇到过,二是我们的的确确还不知道这种所谓的“微生物”本质是什么东西。也就因为界定的模糊,现在有很多同行遇到问题很容易就往“黑胶虫”上归咎,其实很有可能只是细胞状态不好时漂点碎片,包括支原体污染导致的,或者血清灭活时间长了出沉淀之类,可一旦归咎于“黑胶虫”,就好像名正言顺的成了“不可抗力”:反正我也不知道是怎么回事,姑且就当是“黑胶虫”吧。可能进来的同行看到这里砖头已经举到半空了,但我认为这问题是确实存在的,需要大家重视。除了上面几位令人尊敬的积极做实验证实的同行们,进这贴的人可能有很多都是细胞不明原因的状态不好,进来看看能不能靠上“黑胶虫”的边的。
我们是做科学的,而现在“黑胶虫”已经快成了我们科研中的迷信,请慎重讨论“黑胶虫”,不要轻易用一个不知道是什么的东西来试图解释手中的现象,希望你相信自己的困惑是可以用我们目前已知的原因解释并且可以解决的,认真寻找原因才是正道。

说得很有道理的。
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生物迷[使用道具]
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大家帮忙看一下这是什么污染?


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我们实验室养的肿瘤细胞中也出现了类似的问题,细胞传代密度低时就长不起来,而且在贴壁细胞生长的空隙里密密麻麻布满了小黑点,如果细胞密度大状态好,小黑点就少。还有像colo205这种半贴壁细胞,密度低细胞就不长,密度高细胞就抱成一团成为很难看的形态。如果勤换液并且每次换液时都以较低转速(700-800rpm)离心的话,黑点就能明显减少。我们用Hd的MycoScan支原体检测试剂盒分别检测了培养基,血清,以及细胞培养上清,PCR的结果是培养上清(+),培养基(-),血清(-)。用药典上的方法,VERO细胞染色结果跟PCR结果一致。
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我们尝试在培养基中加入sigma的Tylosin,按照说明书1ml/L的用量,持续传代了将近一个月的时间,又去做了检测,PCR的结果和hochest染色结果仍然都呈阳性。我拍了污染物油镜下的荧光照片,但是不知道怎么放上来。
我有疑问的是,如果如检测结果显示,是支原体污染,那么支原体是我们平常在细胞间10X的目镜下就能看见的么?还有,支原体会动么(我们可以清楚观察到它们在“布朗运动”)?
还有,我认为如果操作小心的话,是不会在空气中传播或者交叉污染的,因为我用来做检测的VERO细胞是跟这些细胞养在同一个培养箱里面,也是同一个安全柜里操作的,用的PBS和胰酶是同一瓶,不过不会同时操作,VERO一直都是干净的。
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hold住[使用道具]
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而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者认为是微生物的分裂扩增。
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windy+++[使用道具]
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很感谢,我现在养的NCI-H157也有类似的情况,刚复苏的一两代,细胞生长很好,也到后面细胞就自己凋亡了。很郁闷。
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阿敏[使用道具]
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我现在养的细胞也有小黑点,没有人试过加氨苄和卡那处理么?我去年加过,小黑点没有了,但是今年重新养了隔壁实验室拿来的细胞后,就又出现小黑点了,而且培养基不变浑浊。如果是培养基沉淀物的话,那么为什么抗生素有效呢?如果是细菌污染的话,为什么我照射紫外,培养箱和安全柜都用碘酒擦过之后再用75%酒精擦拭之后,再养未污染的细胞,细菌又出来了呢?细菌没这么顽固吧。
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abc816[使用道具]
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最近自己培养的细胞也出现了同样的问题,我是同时培养两种细胞,使用的基础培养基、血清都是一样的,但是就是其中一种几乎看不到黑胶虫,另一种细胞受影响却非常大。因为是贴壁细胞,使用无菌的PBS洗几次之后,感觉情况要好很多。血清换了新的,抗生素也加过,但是基本没有什么效果。同批复苏的几瓶细胞,总会有1瓶,在一夜之间就充满黑胶虫。不知道有没有战友有经验的。
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笑弯了腰[使用道具]
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我用的时GIBCO 胎牛血清,SIGMA的DMEN 培养基,养的是hek293 开始还可以,大约是第四代吧,突然就不行了,细胞多的时候,不明显。细胞少的时候,就很多,而且增长很快,高倍镜下,呈小黑点样,好像有些有融合。做布朗运动。

我是有一天,冻存了细胞以后,在空培养瓶里加了一些培养基,在镜下发现的。开始细胞多的时候没有发现,或者没有注意。

现在我把严重的培养瓶等都扔了,包括六孔板等。
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