浅析培养温度对可溶蛋白的含量的影响

一般来说蛋白在生物体中含量都是非常小的,如果想研究此蛋白,可能需要非常多的生物组织材料。而这些组织材料可能是非常昂贵的,直接进行蛋白纯化是不行的。因此需要借助基因工程技术,将得到的编码蛋白的核酸序列导入到某个宿主细胞,来使其大量表达。对于重组蛋白表达与纯化来说,原核表达系统是一个应用较为广泛的蛋白表达体系,它具有能够在较短时间内获得基因表达产物,所需的成本相对比较低廉等优点。

大肠杆菌表达系统是一种重要的原核表达系统,它能够高效快速地获取高纯度的蛋白。然而在大肠杆菌中,当外源蛋白表达水平高的时候,极易形成包涵体,不利于下游蛋白纯化工作,因此需要注意提高目的蛋白的可溶性表达。温度是影响目的蛋白的可溶性表达的重要因素之一。美迪西科研人员建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台,提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。

研究发现大肠杆菌的最适合生长温度在37~39℃之间,在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体。如果只是想获得包涵体,比如用于后期的抗体制备,那么37℃诱导2~4小时就足够了。较低温度的诱导,目的蛋白的合成速度较小,反而容易形成有活性的蛋白。比如30℃或25℃诱导,甚至低温(15~20℃)长时间诱导(过夜)。低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例,但是培养温度也有一个下限,一般为8~10摄氏度。通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度,以降低有聚合倾向的中间体的浓度,有助于提高目的蛋白的可溶性表达。

广泛地存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中的β2微球蛋白,是由淋巴细胞、血小板和其他大多数有核细胞产生的一种低分子量血清蛋白质。当肾小球或肾小球滤过功能受损,尿液和血清中的β2微球蛋白增高。β2微球蛋白的调控异常可直接参与癌细胞的发育,被认为是多种恶性肿瘤的预后指标。采用基因工程进行β2微球蛋白的重组蛋白表达与纯化究,来获得更高浓度的可溶性β2微球蛋白,可为实验室提供优质和廉价的标准物质。

如有研究者采用大肠杆菌表达系统进行了人β2微球蛋白基因的稳定和高效表达研究,研究者采用逆转录PCR技术,从 Raji细胞株获得β2m的基因序列;将其与改建后的质粒pBv220连接,转染大肠杆菌BL21,经42℃诱导后,以SDS-PAGE鉴定阳性表达克隆,产物经过柱纯化。结果获得了编码成熟32m的全长 cDNA和高效、稳定表达人β2m的大肠杆菌克隆[1]。结果成功地在大肠杆菌中获得了β2m基因的高效表达,为制备主要组织相容性复合体(MHC)-四聚复合 物系统奠定了基础。

通过优化人β2微球蛋白在大肠杆菌中的表达条件并对重组蛋白进行纯化,以期获得可溶性好、纯度高的重组人β2微球蛋白(rhβ2M) [2]。通过检测诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响,确定最佳的诱导条件为IPTG终浓度0.8mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间6h。在最佳诱导条件下进行发酵培养,获得可溶性rhβ2M占菌体总可溶蛋白含量的63.7%。对可溶性蛋白进行Ni Sepharose 6Fast Flow亲和层析纯化,可获得纯度达95%以上的rhβ2MWestern blot分析表明,该蛋白具有与抗人β2M抗体特异反应的抗原特性。

在重组蛋白表达与纯化中,在某些情况下,不同的培养温度都能表达可溶性蛋白,但是低温培养更有利于可溶性蛋白表达。然而外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达毕竟是一个系统的工程,包含着许多的环节,温度只是其中的一个影响因素而已。因此在研究中,还需要多积累经验,并及时汲取相关领域研究的最新进展,来找出提高目的蛋白可溶性表达的方法。

[1]人β2微球蛋白基因在大肠杆菌中的稳定、高效表达[J].

[2]人β2微球蛋白原核表达条件优化及纯化[J].