小中大块大了，不易贴。愈小愈易贴。开始加的培养基少点，能盖上块就行。不必怕细胞差营养，这时细胞在适应新环境，代谢较低。翻转时动作要慢而清。
浮起一大片，我还没碰到。起初我干涸3h，后来干涸缩短为1h，浮起也不多。
祝好运！
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原代培养人血管平滑肌细胞也4、5个月了，感觉很多东西都是小马过河，特别是很多细节问题，需要自己一步步摸索。我一直用的是贴块法，也试过几次酶消法，经过一段时间的摸索出了一套规律，但是还有几个问题请教liguofan或者站内的其他高手，都是自己的体会，也希望多喝战友们交流。
首先是组块的大小。文献上都是说1cm3大小，我刚开始做的时候教我的人说是尽量剪成肉糜状，越小越能萌出细胞。但试了几次都没长出细胞，后来思考像这样一顿乱剪虽然能剪得很碎，但边缘很然保证平齐，细胞是不是也会溢出流失，后面我都是很规整的剪（用的是眼科剪和显微剪），主要保证边缘的平齐，发现果然有细胞萌出。但是面临一个问题就是整个培养皿/瓶萌出细胞的组块比例较低.总共贴的五六十块，多的话十几块能长出，少的话也就几块。（我看过一片国内文献报道贴块法能长出细胞的组块比例也就20%~30%）。各位高手实践下来的结果如何？是否组块越小（<1cm3）长出来就越多？我自己的体会是相对于大小和贴块的间距来说组块边缘是否平直更重要，但如何提高组块长出细胞的比例？
其次是干涸时间。文献上有说1~2h，有3~5h，有12h的，我现在掌握的是6~8h，加液以后绝对静置5d，浮起来的比较少。但看了本贴其余战友的经验，就我干涸的时间长，所以组块长出细胞不多是不是和我干涸时的间太长也有关，是否应该尽早接触营养为好？
第三个也是一直困扰我的问题。贴块法细胞生长速度、密度不均，有的组块细胞长的早、快、多，有的细胞长的晚、慢、少，还有的压根就长不出，这样如何把握传代的时机？只有少数几块长的密的时候传代吧怕细胞数量不够，其他长得还不不多传了也可惜。但等的时间一久，早先长出来的细胞状态就不行了，形态改变、贴壁性变差、凋亡，有时换液后贴壁的细胞被成片地卷起或是冲下来。我曾试过等到所有能长出细胞的组块周围都长密时需要6w左右（文献上说传代时间一般2~4w）,各位高手是如何把握这个传代时机的。
第四个问题是组块浸泡在培液时间久了就会掉丝状、片状的碎屑，有时是黑点状成团聚集附于细胞表面，整个培液肉眼上看是澄清的，但是镜下就觉得脏兮兮的。上次做TEM，电镜下看到细胞内都是一团团吞噬黑点的溶酶体，电镜老师说是支原体污染，后来想想是不是吞噬了黑点状的组织碎屑。各位高手有遇到这种情况吗？如何解决？
第五个问题是培液血清的浓度。我要做SMC表型方面的研究。有老师告诉我想要保持SMC的收缩表型用的培液血清浓度就不能高，而且浓度低的话组块反而能长出细胞，但文献上原代培养血清浓度用20%的多。我20%和5%都试过，同一标本的细胞都能长出，还试过先用20%长出细胞后换用5%的养，观察下来用20%的原代细胞增殖得挺快，也没见到明显的形态变化，用5%的细胞增殖的也不慢。但对于P1以后的细胞，出于保持表型稳定的考虑我就不敢用20%的了。我采用的方法是P0传代时用20%，贴壁后换用5%的培液（文献上好像P1以后用10%的多），P1细胞增殖的也挺好，但P1传P2时我直接用5%，第二天观察细胞根本不贴壁，请高手分析原因？就算细胞对培液有个适应的过程，那传代之前用5%也养了一段时间了，难道P1以后每次传代都要先用20%贴壁再换血清浓度低的培液？
第六个问题是有关酶消法。有感于贴块法虽然操作过程简单但耗时长、获得原代细胞数量少。因为还是涉及SMC表型的问题，不知道大家有没有体会，我是感觉时间越长、代数越久SMC肯定要从收缩型转化成合成型，所以我希望P3以内能获得尽可能多的细胞。文献上有关酶消法也是众说纷纭：比如酶的种类和浓度，种类有胶原酶、木瓜酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、胰酶，还有的是几种酶的组合；浓度从0.1%~0.5%不等，0.2%和0.25%较多；时间更是五花八门，少则15~30min，多则十几小时；消化状态有的把握至血管完全溶解，有的是组织边缘呈絮状；我试了几次，一开始用的酶浓度比较低，血管碎块在酶液里是纹丝不动啊，后来考虑人主动脉细胞外基质的含量肯定高于动物，昨天改用更高浓度的酶并分两步消化：0.25%I型胶原酶+2mg/ml牛血清白蛋白消化2h，0.25%I型胶原酶+0.5%弹性蛋白酶+2mg/ml牛血清白蛋白消化30min~1h，结果是血管块从肉眼上看变化不大，镜下看边缘似乎有絮状的感觉，酶液中有漂浮的小光亮点（不知道是不是消化下来的细胞，量不是特别多），其他步骤照葫芦画瓢，不知道最终结果如何。我觉得我的酶浓度很高了，但要想将人血管组织完全消化掉估计要得十几小时，这样消化下来的细胞估计也破坏了，请各位有经验的高手请指教。个人感觉酶消法条件的摸索好难，代价又大，像我这样的浓度，一支100mg的胶原酶和弹性蛋白酶都只能配20ml的酶液，用不了几次。
