气相色谱

我做的相关实验美国药典已有收录，他用了标准加入法，一共4个点，A（定量限），B，C，D，分别加入0.5微克,1微克,2微克，0（未加入），也加了一定量的内标，纵坐标是峰面积比。A,B,C都能测到，D是未加入的，可能测不到，因为是杂质检查，这个杂质的量相当小，由A,B,C三点做一直线，外推此直线，延长线与X轴的交点与原点的距离即为药品中此杂质的含量。
以下是曾经泽老师（生物药物分析）中对标准加入法的描述
bbcodeurl('http://www.antpedia.com/attachments/2011/12/59106_201112120757161.png', '%s')


和示意图
bbcodeurl('http://www.antpedia.com/attachments/2011/12/59106_201112120758271.png', '%s')



与美国药典所阐述的一致。
我的问题是：1 如何证明A-C的斜率与小于A的某一浓度范围内的斜率是一样的？ 换句话说由A,B,C三点做出的直线的斜率是K1，在小于浓度A（定量限）的某一范围内是测不出杂质的，它也有一个线，此线的斜率是K2，以上面的方法来看已经默认了K1=K2，那有没有直接的证据说明K1=K2？为什么要认为定量限以下的浓度所做得线性和之上的就一样呢？有没有相关书籍详细介绍了标准加入法的原理或方法的？
  2 标准加入法的方法学怎么做？线性翻多少倍，加样回收率加多少样？怎么做？请详细说明
  3 我还有个问题就是虽然做的是相同的样品，但由于仪器的不同导致定量限有很大的差别，人家是0.5微克/毫升，我们是15微克/毫升，比人家的高好多，如果以后只能用这种仪器来做，那我如何知道我的线性和人家低浓度的线性是否一致？更何况用低浓度的样品测得的数据本身就不稳定，稍有偏差，所得截距就会变化很大，所以我觉得还是从理论的源头研究，既然人家用了标准外加法，那我就得找到这种方法的依据，它在做线性的时候有没有什么规定翻多少倍？方法学怎么设计？等等

万分感谢

[ 本帖最后由 xiaoxin2809 于 2011-12-13 11:49 编辑 ]

从理论上来讲K1应该很难等于K2。
除非是A,B,C3点拟合成的曲线的截距为D，且相关系数为1，不过这在实际的测试中很难实现。
从楼主贴得资料已经明显，由于样品的响应较低，对于定性和定量有难度，那么取几份等体积的样品，加入等体积单浓度成梯度的标准溶液，然后测定加入标准溶液后的样品的响应后绘制成上图的曲线，然后延长曲线与浓度轴相交得出样品浓度。
所以其实这种方法只能算是一种推论式的方法，楼主没毕业去纠结K1为什么等于K2。

定量限以下的数据误差比较大
或许正是因为楼主所说的，无法用直接的证据证明定量限上下的线性是一致的！

1、标准加入法通常用于两种情况，一种是低含量组分，一种是存在基体干扰的组分。而实际上，低含量组分不直接测也是因为会有较大的仪器噪声干扰。它不是假设K1=K2，而是依据Lambert-Beer定律所作的推论。
2、方法学主要是准确度和精密度的验证。
配制相当于杂质浓度的标准溶液，同法操作，验证准确度；用该标液和某一批的样品溶液用该法反复测定，验证精密度。

“不是假设K1=K2，而是依据Lambert-Beer定律所作的推论”这一点您能详细解释一下吗？或者有没有哪方面的书籍参考，请告诉我吧，我已经被这个问题困扰好久了。

"配制相当于杂质浓度的标准溶液，同法操作，验证准确度"
这句不太明白，准确度用加样回收率表示，加入的量是推测出样品含有的量吗？很可能达不到检测前诶？

[ 本帖最后由 xiaoxin2809 于 2011-12-12 20:48 编辑 ]

准确度就是用“检测值/真实值（或理论值）”来衡量，所以最直接的方法就是配一个已知浓度（与试样中浓度相当）的待测物标准溶液，测量其含量，计算回收率。当然你也可以用加标回收做。

Lambert-Beer定律的内容就是浓度与对单色光的吸光度成正比关系，加入的标准物和待测物本身都是同一物质，它们的吸收系数自然是一定的。我们说的线性范围主要指最大浓度范围，受检测器量程和柱效限制；对于稀溶液，不存在柱超载或是检测器测量范围的问题，但是检测器噪声的干扰凸显，所以用了加标法，通过10倍噪声以上的检测信号外推直接测试干扰较大的10倍噪声以下时的待测物浓度。

加标法也是一种测试方法，如果你认为理论不通，也可以用直测法，需要使用前处理方法先对待测组分进行富集，再测试。方法的优略可以通过比较准确度、重复性及准确度要求和相应的工作效率等方面予以甄别。

嗯，您说的我听懂了，但我还有个问题，就是虽然样品相同，但由于仪器的不同，人家的定量限是0.5微克，而我的定量限是15微克，虽然都是外推，那我的定量限比人家高好多，做出的截距是不是一样的？所以我还是得找到标准加入法的依据啊。
各位老师有没有相关书籍介绍这方面的吗？

这个标线的延长，应该是理论不充分的。

标准加入法的回收率跟回收率是一样的，就是多了一次加入标准。这个标准就是将来测定样品时，你打算加入的量，报告的时候，还是报告减去加入标准的定量限。这个说法可能不太准确，欢迎指正。

K1和K2不可能完全一样，我们考察定量限，只要保证定量限在检测的线性上，物质的毒性可控就好了。最重要的是，在定量限的回收率一定要好，如果定量限的回收率很差，那么这个物质可能残留在样品溶液中很多都没有测定出来。

这个斜率跟定量限没关系，跟仪器系统本身有关系。否则，全世界做一根直线就行啦，就像液相色谱可以有通用的校正因子一样，但实际上是不可能的，因为峰面积跟色谱条件是有很大关系的，而相同色谱条件在不同的系统配置中表现也不一样。所以，跟定量限没关系，不同仪器测同一物质斜率不一样很正常。