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标题:[求助]大鼠乳鼠心肌细胞培养

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #10 爱老虎游tt 的帖子

谢谢！
说实在，我养心肌已经有一个多月了，养了10几次了，心中烦闷。总是消化所得的细胞数目很少，并且状态不好，贴壁差，死细胞多，不跳动，已经快丧失信心了！找不到是什么原因，觉得科研真是太难！听大家说说心里才有了点底子。
我消化心肌是不吹打，剪碎后放入青霉素瓶中，直接在37°C摇晃的。就跟你说的那样，就是4分钟消化也很粘稠，难以吸出上清。
你说的磁力搅拌器我们实验室里没有，能自己制作么？
谢谢！
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生物迷[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

磁力搅拌子可以自己制作，我们就是把大头针折断，然后放入离心管或带有帽的试管。磁力搅拌器是科室买的，好像也不太贵，几百元。但用处很大，配置药物时用的很多。如果是水浴振荡的话效果应该不错的啊。试着把振荡的速度加快，或者在青霉素小瓶中将心肌组织剪碎后转移至离心管中，这样的话振荡的幅度会加大，效果会不会好些呢，个人感觉青霉素小瓶的容积太小。
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ha111[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我重新配制了胶原酶，胰酶，上次配制酶用的PBS时候没有调节PH值，这次调成了7.2。培养基换成了高糖的DMEM。还是原来的消化办法，10只老鼠消化下来将近2小时。（因为实验室都是用此法消化，也没有再按楼主所说自创新法）
培养48小时后观察，心肌细胞有微弱的搏动，但细胞低倍镜下观察发黑，实验室的人说是状态不好，快死亡了，不知什么原因，希望大家给点意见。
谢谢！
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caihong[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们配胶原酶,胰酶也没有调节PH值,但我们的培养基(高糖)跟血清都用新鲜的,就是买回的胎牛血清分装成许多小份,在做实验当天临时拿出配制,这样做的目的是为了保证培养基与血清的营养成份都不丢失.所培养的原代小鼠心肌细胞捕动还不错.
不知你说的细胞发黑是什么?
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哦，我们的是先把DMEM配成1000ml，分装成200ml一瓶，余下的-20°C保存，将血清加入，配成20%FBS，不过这要很多次才用完。
我细胞发黑，自己分析是细胞濒临死亡。跳动弱。
后来我按帖子中群友所提方法，将混合胶原酶降为0.05%，胰酶仍为0.01%
再培养，细胞状态就好点了，没有明显的发黑的情况了，不过就是收获细胞太少了，我10只乳鼠心脏才养2个50ml瓶子，这样细胞密度才够大，以前养3个，细胞很稀，不会出现抱团搏动。我也不知道具体在哪里损失细胞了，最可能是离心后去细胞沉淀时，想问问你们是怎么克服的？
另外想请教下，你们向培养基中加BRDU和HEPES么？具体怎么加啊？
你们做过心肌细胞纯度分析么？具体用什么方法啊？我的问题是不是太多了，可以选择性回答，不好意思。
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发表于 2011-12-15 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果有条件可以加BRDU。或者先不加BRDU直接用免疫细胞化学染色法鉴别心肌细胞的纯度，如果能达到实验的要求就可以了。具体的方法就是利用心肌细胞肌节性肌动蛋白（α-sarcomeric actin）的免疫细胞化学染色法进行心肌细胞的鉴定，可以先搜索一下本版。
1在细胞接种到培养板之前将事先用多聚赖氨酸处理过的盖玻片放在培养板内，然后在培养板内接种细胞进行培养。
2细胞培养 72 小时后，将盖玻片取出，用 4℃PBS 冲洗 3 次。4%多聚甲醛室温下固定 20 分钟，PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
3 3%H2O2 孵育 10 分钟，PBS 冲洗 5 分钟×3 次，滴加封闭血清，室温孵育 15 分钟，弃去血清。
4滴加一抗（α-sarcomeric actin），阴性对照采用 PBS 代替一抗。
5 4℃湿盒过夜孵育。PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
6 滴加生物素标记二抗，37℃，反应 15 分钟，PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
7滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，37℃，反应 10～15 分钟，PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
8 DAB 显色，蒸馏水充分冲洗。
9复染，脱水，透明，封片。
10 观察、拍照
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主解说清晰，是第一人。
不过我这两次听从建议，已经能使心肌搏动了，我有后续的心得，随后慢慢道来，大家给了很多有用的建议。
将胶原酶浓度降低后，没有影响消化，一半第1次37°恒温消化10分钟弃上清，第二次就改为8分钟，后来就是3分钟，2分钟，总共就8次左右就使组织消化完全，如此养了细胞搏动起来了。
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发表于 2011-12-15 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
生物迷 你好！很开心能遇上同道中人！我是新手上路，请多多指教。我刚刚做了一次原代，虽然能长出很多细胞，形态和心肌细胞相似，但是搏动的细胞不多，传代后却见不到搏动，而细胞却继续增值。现在我很惆怅，不知道这些细胞是什么？也不知道真正的心肌细胞到底长什么样？所以我想问你有没有培养的心肌细胞照片
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生物迷[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #18 DNA 的帖子

你好，关于心肌细胞的图片可以搜索本版。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3168731&sty=1&tpg=1&ppg=7&age=0#3168731')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3168731&sty=1&tpg=1&ppg=8&age=0#3168731')
能具体说一下你的培养过程吗，用了差速贴壁吗。多长时间观察的。另一般认为成年的心肌是不能分裂的，所以心肌一般用原代培养，基本不能传代。你为何要传代培养啊。
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2011-12-15 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎样判断心肌细胞的生长状态好不好啊？我只知道细胞搏动了，不知道好不好，是否可以用于实验处理。文献上都是说3天后就用于实验分组处理了。
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